研究背景：骨肉瘤(Osteosarcoma)是骨组织临床上最常见的原发性恶性骨肿瘤。它好发于青春期少年及儿童,是青少年及儿童比较常见的恶性肿瘤。它发生于间叶组织,以成骨特性为主要特性的恶性骨肿瘤,骨肉瘤发病后进展快、预后差,目前主要以手术治疗为主,比如肿瘤关节的置换等保肢手术或截肢术,以及相应的放疗化疗等手段。但是骨肉瘤恶性程度高,对化疗药物不敏感,导致病人5年生存率即使应用新的化疗方案也不超过70%,单一手术更是不超过20%。并且骨肉瘤的另一特性：早期发生转移,可于数月内就发生肺转移,导致骨肉瘤病人一旦发生转移后即使应用新的化疗方案,5年生存率没有明显的提高,或者说没有改变。这似乎形成了骨肉瘤治疗的瓶颈,近年来对于骨肉瘤的治疗逐渐形成了手术前化疗然后尽量行保肢手术,手术后给予化疗的公认的治疗流程。但是对于病人的治疗效果没有进一步的提高。所以大家逐渐把目光转移到了骨肉瘤的病因学的研究上来,逐渐研究到分子水平。并且取得了很多的研究成果,比如发现了它的染色体突变,p21基因、INK4a/ARF基因等抑癌基因和HER2基因、BMI-1基因等癌基因发生突变导致了骨肉瘤的发生。以及这些基因所代表的细胞因子通过什么样的机制比如导致一些信号转导途径的该表导致了骨肉瘤的发生等等。有人大体统计关于这方面的研究甚至达到了2万多报道。但是所有的这些均没有得到世界上所有相关学者的一致公论。近年来肿瘤干细胞理论被大家所关注,并且进行了大量的研究,并且分离出了肿瘤干细胞,证明肿瘤干细胞是客观存在的。本课题正是基于这一理论的基础上进行的设计实验的。微小RNA (microRNA、miRNA)是一类近年来发现的内源性多功能小分子RNA, miRNA首先在秀丽隐杆线虫中发现,成霖-4可以调控线虫的顺序发展。随后的研究发现,在水稻中,果蝇,线虫,病毒,小鼠和人类中均存在miRNA。在一般情况下,miRNA是由19-25个核苷酸组成的具有高度保守特性的小分子,科学杂志认为miRNA的发现是在2002年和2003年的十大科学进展之一(Garajova et al.,2014; Luo et al.,2014)。目前确定的miRNA有4500多个。微RNA是属于一类的非编码RNA,其具有其中基因表达的调节作用。基于miRNA的高度保守的遗传特性,它可以通过上调、或者下调靶基因的表达并且miRNA能抑制转录后基因表达,使微RNA参与许多生物过程,诸如细胞增殖,分化和凋亡等。并且认为它的主要作用机制就是与下游基因通过3’末端的完全或者不完全配对来影响下游基因的转录抑制翻译等方式来起作用。miRNA的berant表达与各种癌症的发展有关,并且与不同种类的癌症具有强的相关性。随着科学技术的不断发展及大家对它的认识的不断发展,miRNA的表达和生物学功能已在多种肿瘤都有研究。比如有miR-145对于乳腺癌来说可以起到抑癌基因的作用。同样在肝癌中miR-122也同样起着抑癌基因的作用但是miR-221/222却起着癌基因的作用。鉴于他们在肿瘤中的重要作用,miRNA的被广泛认为是血液学和肿瘤组织的生物标志物。并且其在骨肿瘤中的作用不断的被研究,并且取得了很多的成果。MIR-184是一种新颖的miRNA,其在肿瘤中的作用仍不清楚。研究表明,它在不同肿瘤中的异常表达,并可调节肿瘤的发生。最近的研究表明,micro 184在多种肿瘤中的异常表达,可以调节肿瘤细胞的生长,分化,侵袭,转移(Wong et al.,2009; Cui et al.,2014; Gao et al., 2014)。并且有的学者研究发现它还可以诱导新生血管的形成。它在有的肿瘤中起着癌基因的作用,比如有人通过研究认为它可以促进神经胶质瘤的发生并增加其侵袭性。然而在肾癌中,它却可以明显的抑制肾癌细胞的生长、促进细胞的凋亡,并可以明显的抑制肾癌细胞的转移浸润。目的：体外培养购买来自ATCC细胞库的大鼠骨肉瘤细胞株(SOSP-M),通过细胞的传代培养并经过免疫组化检测合格后,使用Trizol法提取RNA后,应用引物经过逆转录合成cDNA,应用实时定量检测PCR方法检测miR-184的表达,首先检验miR-184抑制剂和模拟剂对miR-184在骨肉瘤细胞中表达的影响。在确定miR-184模拟剂和抑制剂对miR-184在骨肉瘤细胞中的表达有统计学意义的影响后,应用MTT法,研究对照组及应用miR-184模拟剂和抑制剂及A、B、C组骨肉瘤细胞的增殖情况来检测miR-184对骨肉瘤细胞增殖性的影响,然后应用Transwell法,研究研究对照组及应用miR-184模拟剂和抑制剂及A、B、C组骨肉瘤细胞侵袭性的改变来检测miR-184对骨肉瘤细胞侵袭性的影响,研究miR-184对骨肉瘤细胞的增殖性及侵袭性的影响是否有统计学意义。最终通过验证期miR-184对骨肉瘤细胞的作用,确认miR-184对骨肉瘤细胞的增殖性及侵袭性有正向作用,即miR-184可以促进骨肉瘤细胞增殖,并且可以增强骨肉瘤细胞的侵袭性,希望能够为骨肉瘤的治疗提供一种新的生物靶标,能够为骨肉瘤的治疗提供一种新的手段。方法：第一部分：参考国内外对骨肉瘤细胞的复苏培养方法,通过将骨肉瘤细胞复苏、传代等技术体外培养大鼠骨肉瘤细胞(SOSP-M).并且经过免疫组织化学的检测,检测合格后,将对数生长期的细胞分为三组：正常对照组(A组),应用MIR-184模仿剂组(B组),和应用MIR-184抑制剂组(C组)。然后将MIR-184模拟剂和MIR-184抑制剂分别转染到B、C组中,应用Trizol法提取RNA,使用逆转录试剂盒合成cDNA,应用实时定量PCR方法检测MIR-184的表达,应用统计学分析,应用MIR-184模仿剂和抑制剂后对MIR-184的表达是否有统计学意义。检验MIR-184模拟剂和抑制剂的有效性。实验重复三次。第二部分：主要是应用RNA干扰技术,细胞培养传代技术同上。将对数生长期的细胞分为三组,应用Trizol法提取RNA,使用逆转录试剂盒合成cDNA。所用的引物是通过PrimerPrimier6.0设计和生工合成。基因表达水平使用优化的比较Ct(△△CT)值法进行定量。应用实时定量PCR方法检测MIR-184的表达,应用MTT比色法,将细胞分为三组,即正常对照组(A组),应用MIR-184模仿剂组(B组),和应用MIR-184抑制剂组(C组),根据骨肉瘤细胞的增殖情况,检测MIR-184对骨肉瘤细胞增殖的影响。实验重复三次,并计算细胞增值率。第三部分：细胞培养传代技术同上。基因的提取和扩增方法同上。应用实时定量PCR方法检测MIR-184的表达,用Transwell检测方法检测骨肉瘤侵袭能力的变化,也是将细胞分为三组,即正常对照组(A组),应用MIR-184模仿剂组(B组),和应用MIR-184抑制剂组(C组),将10个视野中迁移到膜的下游的细胞进行计数,检测MIR-184对骨肉瘤在应用MIR-184模拟剂及MIR-184被抑制后侵袭性的变化情况。实验重复三次。统计分析：所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析(Chicago, IL, USA).。数据被表示为平均值和标准差(±SD),采用单因素方差分析或配对t检验分析方法间的差异性,P值小于0.05被认为有统计学意义结果：(1)相差显微镜下形态观察SOSP-M传3-4代后几呈单一的梭形细胞,并且培养细胞95%以上为GFAP染色阳性细胞。(2)在与对照组相比中,miR-184的表达在miR-184模拟剂组(B组)显著增加(P<0.05)。miR-184的表达在miR-184抑制剂组(C组),miR-184表达明显减少(P<0.05),(3)在与对照组相比中,在miR-184模拟组(B组)骨肉瘤细胞的增殖被显著增强(P<0.05),然而在miR-184抑制组(C组)骨肉瘤细胞的增殖被显著抑制(P<0.05),(4)在与对照组相比中,在miR-184模拟组(B组)骨肉瘤细胞的浸润能力明显增加(P<0.05),然而在miR-184抑制组(C组)骨肉瘤细胞的侵蚀能力明显下降(P<0.05)。结论：(1)本实验骨肉瘤细胞经过传代后实验可靠有效,(2)miR-184的模拟剂和抑制剂可以明显增强和抑制miR-184在大鼠骨肉瘤细胞中的表达(3)miR-184的表达在被模拟剂增强后可以显著增强骨肉瘤细胞的增殖,并且miR-184的表达在被miR-184抑制剂抑制后骨肉瘤细胞的增殖性明显降低,证明骨肉瘤细胞的增殖性被抑制。(4)miR-184的表达在被模拟剂增强后可以显著增强骨肉瘤细胞的侵袭性,并且骨肉瘤细胞的侵袭性在miR-184的表达被miR-184抑制剂抑制后明显降低(5)本实验研究表明miR-184直接参与了骨肉瘤的发生和发展有关,并参与了骨肉瘤转移。MIR-184参与了骨肉瘤的发展和转移的调控,并可能代表在临床上诊断骨肉瘤的临床标记物,并且有可能是治疗转移性骨肉瘤的新的治疗靶点。