研究背景：涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma of salivary glands, ACCs)又称圆柱瘤(cylindroma),是一种口腔科常见的恶性涎腺上皮来源性肿瘤。它有着局部侵袭性强,区域淋巴结转移率低,嗜神经血管生长,因而易发生血行远处转移等生物学特性,恶性程度高,放疗敏感性却较低。正是缘于此,该肿瘤被手术切除后有着较高的复发率。如能引入基因治疗的方法,提高腺样囊性癌对放疗的敏感程度,则能够给患者的生存率带来明显的改善。由于NF-κB信号转导通路的激活可能是肿瘤产生放疗抵抗性的主要根源之一,通过基因工程技术阻断该通路的表达活性或许能够起到提高腺样囊性癌细胞对放疗敏感性的作用。研究目的：对唾液腺腺样囊性癌ACC-2细胞进行高能X线照射后,在不同时间点上,通过多种方法检测细胞中NF-κB信号转导通路亚单位——p65蛋白表达程度以及细胞凋亡情况,并探究两者之间的相关性,从而获得一系列图像与数据资料。为进一步的放疗增敏实验、动物实验以及最终的临床应用打下良好的基础。实验方法：复苏并传代培养ACC-2细胞系。在细胞进入对数生长期之后,对其进行2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy五种剂量高能X线照射。在随后的1h、3h、6h、10h、24h、48h六个时间点上,分别采用以下四种不同的实验方法来实现对NF-κB信号转导通路活性的检测和细胞凋亡的统计与观察：通过免疫细胞化学法观察各放射剂量组P65蛋白在细胞中的表达随时间和空间变化的情况,并拍摄留取图片资料；通过免疫蛋白印渍(western blotting)法,对细胞中P65蛋白含量进行半定量检测,以获取其在受到放射线照射后表达量的递变规律；最后,对不同时间点上细胞凋亡率采用流式细胞检测予以测定,进行TUNEL(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术)试验来观察发生凋亡细胞核的形态,并拍摄留取图片资料。以上各实验过程均严格控制细胞生长的外环境,并设置不接受放射线照射的空白对照组细胞,关键步骤另重复两遍以减少系统误差,采用必要的统计学方法对数据进行进行检验分析。实验结果：1.通过免疫细胞化学法可观察到,正常对照组细胞中P65蛋白很少出现在细胞核内,而多被定位于核周的细胞质之中；在受到放射线照射后,该蛋白开始大量穿过胞膜,渐渐进入细胞核中心区域,这一过程在放射剂量高的组比放射剂量低的组进展更快；2.借助于western blotting, P65蛋白在细胞总蛋白中的含量被发现可随着时间逐渐发生变化,其在各组细胞中表达的峰值大约在放疗后6小时～10小时。同在照射后3小时时间点上,随着放疗剂量的增大,P65蛋白含量也与之俱增。3.经过分析流式细胞检测的数据可以发现：在不同时间点上,细胞凋亡率不断地改变,该实验数据被绘制成曲线后,可见各放射剂量组细胞凋亡曲线的最低点位于放疗后10小时；同样在照射后3小时时间点上,细胞凋亡率随放射剂量的增加而有所降低,对照western blotting结果,则表现出了其相对于P65蛋白含量的负相关关系(应用Spearman等级相关法进行放射线照射剂量强度与细胞凋亡率之间关系的分析；检验水准取双侧α=0.05,结果P=0.010<0.05)。4.发生凋亡的细胞在TUNEL试验中被观察到了较为典型的形态学变化,如染色体浓集、核碎裂以及凋亡小体等,凋亡细胞比率的变化趋势与流式细胞检测的结果相同。研究结论：高能X射线与ACC-2细胞中P65蛋白的表达变化规律之间有着一定的时间——剂量效应关系。即细胞受到放射线照射之后,随时间推移,P65蛋白在空间上浓集的部位不断迁移,最终富集作用于细胞核相关区域,即特定部位与特定时间相对应；其在总蛋白中的含量亦不断改变,即特定含量对应特定时间,此为放射线与P65蛋白表达的时间效应关系。而放射线剂量的增大可以加速同一时间点上蛋白浓集部位的迁移过程,并可使蛋白含量随之升高,此为二者正相关的剂量效应关系。照射后各组细胞凋亡率变化曲线有其各自的特点,凋亡率与其P65蛋白表达量之间呈现出了负相关表现。