近年来用两个近红外光子作为激发光源的双光子荧光显微成像(TPFM)技术已经在生物医学研究领域显示出了巨大的应用潜力。与传统的单光子荧光显微(OPFM)技术比较而言,TPFM技术具有深层成像、定位准、分辨率高、低光损伤和光漂白等优势,最重要的是可以降低信噪比并实现暗场成像。凭借这些优异的特性,双光子荧光探针的进一步研究对生物医学成像的应用提供了重要支撑。TPFM通过结合使用双光子荧光探针,逐渐成为生物医学上众多目标物检测研究中的重要成像工具,与此同时就对有机双光子吸收材料提出了新的机遇与挑战。到现在为止,研发应用于满足不同环境和需求的双光子荧光探针分子数量依然很少,这严重限制了双光子荧光显微成像的发展与应用。因此,迫切需要研发设计创新型、性质优良的双光子荧光探针分子来满足各种目标物的识别需求。本论文从理论化学的角度,利用量子化学计算方法,首次针对生命有毒重金属汞离子(Hg2+)、钯离子(Pd2+)和重要生物β-半乳糖苷酶(β-Gal)、细胞色素P450酶(CYP1A)系统的设计和研究了化学反应型分子内电荷转移机制的的双光子荧光探针分子及其相应的产物分子。致力于揭示影响双光子荧光染料分子的吸收和发射光谱性质的本质原因与分子结构特征,为未来研发性能优良和适用性强的双光子荧光探针分子提供宝贵的理论依据。研究的主要结论如下:1.有毒重金属汞离子双光子荧光探针的理论研究汞是一种有剧毒的重金属元素,进入人体内微量汞即可导致严重的中毒,如头痛,帕金森综合症和水俣病等。因此研发高效检测生物体内的汞离子(Hg2+)探针非常重要。为了实现有效的检测Hg2+,我们基于分子内电荷转移(ICT)机理设计了一系列新型的Hg2+双光子荧光探针DTA(1-9)和相关的反应产物DMAA(1-9)。用密度泛函理论(DFT)和含时密度泛函理论(TDDFT)方法对这些有机荧光分子的基态构型和电子结构特性及双光子吸收(TPA),单光子吸收(OPA)和荧光发射光学性质进行了详细的理论研究,并深入的探讨了不同种类分子与线性/非线性光物理性质之间的关系。基于刚性和具有共轭结构的萘荧光团,通过延展π共轭长度、增强端基供电子强度获得了具有较大双光子吸收截面值的Hg2+双光子荧光探针候选物,并使吸收/发射光谱红移到生物组织所能承受的近红外光谱区,改善了探针辩识度和生物耐受性。DTA6和DTA8探针以及相应的反应产物DMAA6和DMAA8分别具有优异的TPA性质,在近红外区域具有较强的双光子响应,是用于生物系统中有希望的双光子比率型Hg2+荧光探针。这项研究可以为合成近红外区域具有良好TPA性质的新型Hg2+双光子荧光分子提供有用的信息。2.有毒重金属钯离子双光子荧光探针的理论研究由于汽车的大量使用,尾气中的钯离子(Pd2+)通过催化转化反应被大量的排放,严重污染了环境,并时刻威胁着人类的健康,因此对Pd2+探针的研究日趋显得急迫。我们基于香豆素的π-中心扩大的衍生物设计研究了一系列新颖的Pd2+探针(R1-9)和相应的反应产物(P’1-9),并采用密度泛函理论(DFT)和含时密度泛函理论(TD-DFT)方法结合Gaussian程序对它们的电子结构,单光子吸收(OPA)和发射性质进行了系统研究;此外采用二次响应理论利用DALTON程序计算了它们的双光子吸收性质。结果解释了已合成的产物分子P’1荧光增强的原因是助色团和给电子基团?OH降低了分子在激发态的结构变形和振动弛豫,并增大了分子内电荷转移,极大地降低了分子内转换速率。另外指出在4位引入吸电子基团(?Cl或?CN)能有效地减小H?L能隙,使吸收和发射光谱的红移,增大跃迁偶极矩和电荷转移量,可增大分子的单位分子量的TPA截面值。对于探针R4,其产物分子P’4具有更小的内转换速率(KIC:1.28×106 s-1?9.09×1011s-1),并且有最大的单位分子量TPA截面值(3.91)和较长荧光波长(590.3 nm),所以R4是此系列Pd2+探针中综合性能最佳的探针分子。这些基于π-中心扩大香豆素衍生物的设计策略可为进一步研发优异实用的Pd2+双光子荧光探针分子提供有用的参考。3.生物β-半乳糖苷酶双光子荧光探针的理论研究β-半乳糖苷酶(β-Gal)作为一种标记酶,可用于细胞类型和特定半抗原体的甄别,最近报道,非正常β-Gal的活性检测已经成为衡量细胞衰老程度的一种方法,因此对其高效检测变得尤为重要。我们基于萘和喹啉荧光团,通过引入不同生物连接桥(喹啉、苯并噻吩、噻吩、哒嗪)和吸电子基团氰基设计研究了一系列比率型β-Gal双光子荧光探针染料分子。结果表明,探针分子与β-Gal反应后,其产物分子由于有更好的分子刚性结构和更大的跃迁偶极矩,普遍地表现出更长的吸收和发射波长,更大的双光子跃迁几率和更明显的净电荷转移量。在所研究的分子中,净电荷转移量的增加在提高TPA截面值(δmax)的同时降低了辐射速率,因此存在一个TPA截面值和辐射速率(kr)最优化的配比值。研究结果指出,基于研究的分子,苯并噻吩对苯并噻唑的取代(SG3)可获得最大的rmaxk×d值,最大的辐射速率,较长的荧光波长和较大大的双光子吸收截面值。所以SG3是最有潜力的比率型β-Gal酶生物双光子荧光探针备选分子。这项研究还呈现了很多有价值的关于当前一些受欢迎的杂环吸电子基团的光-电子信息,希望能对β-Gal酶的高效检测探针研发提供有价值的信息。4.生物细胞色素P450 1A酶双光子荧光探针的理论研究生物体内的细胞色素P450 1A(CYP1A)酶能够催化大量的内源性底物及临床药物,尤其对肿瘤形成及癌症预防有着重要的影响,因此研发CYP1A酶的高效检测探针具有重要意义。通过在1,8-萘酰亚胺荧光团的N原子位置引入杂环二氯苯、苯并噻二唑、芴基、咔唑基团、苯环基团,设计了一系列ICT机制的比率型双光子CYP1A酶荧光探针及其产物分子。研究表明此系列分子的探针分子与产物分子表现出独立的肉眼可见的荧光信号,这样较大的发射波长差值,增强了探针对目标物的检测效率。理论模拟并解释了实验探针分子的双光子荧光检测行为,主要是离子产物分子中?O?基团的供电子性质引起了跃迁中更多的电荷转移量和更长的电荷转移距离,提供了比探针大的双光子吸收截面;其次离子产物N原子的2Pz轨道参与周围C原子形成较大的π电子共轭结构,有效的降低了能隙,最终导致了产物分子的发射光谱红移。在对所有分子光谱性质的分析研究中发现,所有产物分子都比相应的探针分子有大的分子平面性、较长的吸收和发射光谱、更大的双光子吸收截面值。分子对接研究表明,设计的探针NCMN-3和探针NCMN-5分子保持了对CYP1A的高选择性,证明了此系列探针分子设计的合理性。