乳铁蛋白(LF)是一种具有多种生物学功能的天然活性铁结合糖蛋白，在杀菌、抗病毒、免疫调节等方面起重要作用，是调节动物体液中自由铁离子水平的转铁家族中最重要的成员。天然乳铁蛋白主要存在于动物乳汁尤其是人初乳中，含量可达6-8mg/mL。乳铁素是乳铁蛋白在酸性条件下经蛋白酶消化后从N-端释放出来的一个小肽段，并且抗菌活性强于乳铁蛋白。国外对牛乳铁素、人乳铁素、山羊乳铁素、鼠乳铁素等的抗菌活性进行了比较，结果发现牛乳铁素的抗菌活性最强。牛乳铁素(LfcinB)作为一种广谱高效的抗菌肽，在替代传统抗生素研究中显示了巨大的潜力和广阔的应用前景。由于自然界中的LfcinB资源有限，提取成本高，本试验拟通过基因工程技术建立一个体外高效表达系统，以期为大量获得LfcinB并进行深入研究奠定基础。 本试验根据GenBank中已报道的BLF基因(NO∶NM_180998)，化学合成LfcinB的单链基因序列。以合成的序列为模板，用相应的特异性引物扩增LfcinB基因。结果表明扩增得到的PCR产物浓度高、特异性强，且大小在92bp左右。将PCR产物直接克隆到pMD18-T载体上，经过菌落PCR鉴定和BamHⅠ/SalⅠ限制性内切酶酶切分析，初步确认目的基因已克隆入T载体。将含重组质粒的菌液送上海生物工程公司测序，结果与本试验所合成的单链基因序列同源性为100％，表明扩增得到的是LfcinB基因。 PCR产物经回收纯化后用EcoRⅠ、NotⅠ限制性内切酶进行双酶切，胶回收获得连接用LfcinB基因片段。将原核表达载体pET-22b(+)和真核表达载体pPIC9K分别用EcoRⅠ、NotⅠ限制性内切酶进行双酶切，然后胶回收目的片段。 将酶切的PCR产物与酶切的原核表达载体pET-22b(+)连接并转化大肠杆菌BL21感受态细胞，加入IPTG诱导目的蛋白的表达，分别收集诱导2h、3h、4h的菌液。同时设一个不加IPTG诱导的空白对照和一个经IPTG诱导的非重组菌对照。经菌落PCR鉴定、酶切分析确认LfcinB基因已经插入了多克隆位点。表达产物经SDS-PAGE分析，结果在约3.2KD的位置有目的条带，而对照组没有出现这条带，表明目的蛋白得到了表达，且诱导3h的表达量最高。 将酶切的PCR产物与酶切的真核表达载体pPIC9K连接，用SalⅠ线性化重组质粒，并通过原生质体转化法转入毕赤酵母GS115感受态细胞。用G418浓度分别为0.5、0.75、1.0、1.5mg/mL的YPD平板筛选多拷贝His+转化子，再通过多拷贝His+转化子在MM和MD板上的生长情况进一步确定转化子的表型，最后诱导目的基因在毕赤酵母中的分泌表达。收集的上清经冷冻干燥浓缩后进行SDS-PAGE分析，结果在分子量约为3.2KD的位置有目的产物的带，而对照组没有出现这条带，表明该菌株可以表达目的蛋白，但目的蛋白的条带是经过浓缩后才被SDS-PAGE检测到，表明表达的目的蛋白的量不是很理想。将上清液按同样方法浓缩，用本实验室保存的大肠杆菌对浓缩产物做抑菌试验，初步鉴定其抗菌活性，同时设阴性对照。结果阴性对照孔没有抑菌圈，试验孔有抑菌圈，约为2.4cm，说明表达产物具有一定的抗菌活性。