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第一章GGA诱导AD大鼠海马HSP70表达及对其行为组织学的影响背景与目的阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是一种以进行性记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统变性疾病,病因和发病机制至今尚未完全清楚。近年研究发现,AD脑内存在热休克蛋白70（heat shock protein 70）表达变化,并和神经元的存活有关联。HSP是细胞受到各种刺激时产生的高度保守的具有重要生理功能的多肽类蛋白质分子家族,可通过分子伴侣作用调节蛋白质的正常结构功能及抗氧化、抗凋亡等作用提高细胞对应激原的耐受,保护细胞抗损伤。目前已证实,抗溃疡药物Geranylgeranylacetone（GGA）可明显诱导大鼠胃肠、肝脏、心脏、视网膜等多种器官组织甚至中枢神经系统的HSP70表达。国外已将其应用于脑血管病动物模型,发现可明显诱导脑内HSP70表达而发挥神经保护作用。现国内外均尚未有将GGA用于AD研究的报道。我们通过实验建立AD大鼠模型,观察模型大鼠以及GGA灌胃干预后其海马HSP70表达的情况和行为组织学改变,研究GGA诱导AD大鼠海马HSP70表达及其神经保护作用并探讨可能机制,为临床治疗AD提供新的理论基础和方法。方法健康雄性SD大鼠144只随机分为对照组、模型组、GGA干预组,每组各48只,其中,每组又分为术后1天、术后7天、术后14天和术后21天4个时间点,各时间点每组12只大鼠。模型组和GGA干预组大鼠双侧海马注射Aβ1-42,对照组注射等量溶媒。术后大鼠清醒后GGA组即予GGA800mg/kg/d灌胃,余两组予等量生理盐水灌胃,持续21天。术前及术后7天、14天、21天Y迷宫测试各组大鼠学习记忆能力;各时间点行为学测试结束后处死动物,每组取6只大鼠脑组织冰冻切片行HE染色,观察海马CA1区神经元形态改变;刚果红染色观察Aβ的沉积;每组再各取6只用RT-PCR和Western-blot测定各时间点大鼠海马HSP70基因和蛋白表达变化。结果1.术前各组大鼠获得记忆所需电击次数比较差异无统计学意义（P>0.05）,随时间的推移,模型组大鼠达到学会标准所需电击次数逐渐增加,术后14天与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,术后21天模型组大鼠学习记忆能力下降最显著（P<0.01）。GGA组大鼠术后14天、21天达到学会标准所需电击次数虽较对照组仍有增加,但较模型组明显减少,学习记忆能力明显改善（P<0.05）。2.对照组大鼠海马CA1区细胞排列整齐、均匀,细胞结构完整;模型组大鼠海马CA1区细胞排列不均匀、结构紊乱不整齐、不清楚,神经元减少,至术后21天病理改变最显著;GGA组大鼠不同时间点CA1区细胞较模型组排列相对整齐、均匀,结构也较其完整,神经元减少有所改善。3.模型组大鼠脑组织切片刚果红染色,在海马CA1区与齿状回之间可见染色阳性的物质,周围小胶质细胞相对较聚集,可能为Aβ沉积。对照组大鼠脑组织切片刚果红染色未见Aβ沉积,GGA干预组切片亦未发现明显的Aβ沉积。4.模型组和GGA组大鼠术后1天海马HSP70mRNA表达和蛋白表达和对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）;术后7天、14天、21天模型组大鼠海马HSP70mRNA和蛋白表达较对照组逐步减少,差异具统计学意义（P<0.05）;术后各相应时间点GGA组大鼠海马HSP70mRNA和蛋白表达均较模型组明显增加（P<0.05）,其中14天、21天HSP70mRNA增加显著（P<0.01）。对照组大鼠海马各时间点HSP70mRNA和蛋白表达无明显变化。结论1.AD大鼠海马HSP70表达呈持续低水平,而HSP70的低表达使其神经保护作用减弱,这可能参与了AD的病理发展过程。2.GGA诱导的AD大鼠海马HSP70表达上调可能通过抑制Aβ毒性,减轻神经元损害,增加神经元的存活,从而改善AD大鼠的学习记忆能力。第二章GGA诱导AD模型大鼠海马HSP70表达及对细胞凋亡和凋亡途径相关因子cytochrome C、caspase-9、FADD、caspase-8表达的影响背景与目的海马、皮层区域为主的神经元大量丢失是AD的另一主要病理特征。对AD的研究表明,AD患者认知功能损害与这种海马、大脑皮质神经元的丢失密切相关,而神经元丢失可能主要是由Aβ毒性作用诱导的细胞凋亡引起。caspases途径的激活在触发和执行神经元凋亡中起主要作用,其触发机制包括线粒体途径和胞膜的死亡受体信号通道。已有研究表明HSP70在抗凋亡中发挥了重要作用,但在对其具体抗凋亡机制,特别是对死亡受体途径的作用研究结果不一,甚至矛盾。目前对HSP70在AD活体中的抗凋亡研究未见报道。本研究通过建立AD大鼠模型,观察AD模型大鼠以及GGA灌胃干预后海马HSP70表达变化和神经元凋亡的关系,以及海马组织线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径相关因子cytochrome C、caspase-9、FADD、caspase-8的表达变化,探讨GGA诱导AD模型大鼠海马HSP70表达及其在AD中的抗凋亡机制,为临床治疗AD提供新的理论基础和方法。方法经Y迷宫筛选的健康雄性SD大鼠36只随机分为对照组、模型组、GGA干预组,每组各12只。模型组和GGA干预组大鼠双侧海马注射Aβ1-42,对照组注射等量溶媒。术后大鼠清醒后GGA组予GGA800mg/kg/d灌胃,余两组予等量生理盐水灌胃,持续21天。造模后21天,处死动物,每组取6只大鼠脑组织冰冻切片进行TUNEL-HSP70免疫荧光双标染色,激光共聚焦显微镜观察结果并对阳性细胞计数;每组再各取6只用Western-blot测定鼠海马cytochromeC、caspase-9、FADD、caspase-8蛋白表达变化。结果1.激光共聚焦扫描显微镜观察,造模后21天,对照组大鼠海马CA1-齿状回之间各层区域可见少量胞核为绿色FITC-dUTP标记TUNEL染色阳性细胞,呈小圆形、环形或颗粒状,以及胞浆为红色TRITC标记的HSP70荧光染色阳性细胞。模型组TUNEL阳性细胞较对照组明显增多（P<0.01）,而HSP70表达显著减少（P<0.05）;GGA干预组TUNEL阳性细胞数较模型组显著减少（P<0.01）,HSP70荧光染色阳性细胞则较对照组和模型组均明显增多（P<0.01）;大部分胞浆HSP70免疫荧光染色呈阳性的细胞,其胞核不被FITC-dUTP特异性标记;FITC-dUTP标记阳性的细胞其胞浆则缺乏HSP70表达或HSP70表达较弱。2.模型组大鼠海马caspase-9表达较对照组明显增加,差异具有显著性意义（P<0.01）;GGA组大鼠海马caspase-9表达较模型组显著减少（P<0.01）。3.模型组大鼠海马FADD表达较对照组明显增加（P<0.05）;GGA组FADD蛋白表达亦较对照组增加（P<0.05）,并且和模型组比较差异无显著性（P>0.05）。4.模型组大鼠海马caspase-8蛋白表达较对照组明显增加（P<0.05）;GGA组caspase-8蛋白表达较模型组明显减少（P<0.05）,并和对照组比较差异无显著性（P>0.05）。5.模型组大鼠海马cytochrome C蛋白表达较对照组明显增加（P<0.05）;GGA组cytochrome C蛋白表达较模型组明显减少（P<0.05）,并和对照组比较差异无显著性（P>0.05）。结论1.Aβ1-42可通过诱导大鼠海马神经细胞线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径的激活而促进细胞凋亡,可能是AD神经功能损害的重要原因。2.GGA诱导AD大鼠海马HSP70表达上调的神经保护作用可能与其增强抗凋亡机制,减轻神经元损伤有关。