背景：由成体细胞获得多能干细胞是替代胚胎干细胞治疗相关疾病的有效手段之一，主要通过体细胞核移植技术、特定基因导入和细胞融合获得。体细胞核移植技术因其极低的成功率及克隆动物普遍存在的早衰、早夭现象阻碍了该技术的推广运用，随之引发的治疗性克隆和生殖性克隆亦导致不可避免的伦理学争议。导入特定基因的方法研究中，作为载体的慢病毒可能改写染色体的遗传信息，某些转录因子可能诱发癌症，也具有一定程度的局限性。细胞融合是一项迅速发展的新兴细胞工程方法，该方法通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将两个或者多个细胞通过无性方式融合(合并)成一个单核或多核的杂合细胞。2005年，Cowan等研究人员通过聚乙二醇将人成纤维细胞和胚胎干细胞融合后，杂合细胞所表现出的形态学、生长特性以及体内外分化能力同胚胎干细胞惊人的一致，该研究表明通过细胞融合可实现人成体细胞重编程。2009年，Voldman等利用微流控制技术精确地实现了高效率的细胞配对和融合，并将这种融合技术运用于小鼠胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞，开拓了细胞电融合技术在体细胞重编程研究中的新前景。2010年1月，Blau领衔的研究小组同样采用聚乙二醇融合了小鼠胚胎干细胞和人类成纤维细胞，这种异核体诱导的速度比正常的体细胞诱导速度快很多，仅需1天时间，诱导效率高达70%。上述研究表明细胞融合技术是实现体细胞重编程研究的潜在有效手段，该技术的优点在于：一是可以避免传统的胚胎干细胞治疗所带来的伦理学争议和免疫排斥反应等问题；二是可以有效避免其他体细胞重编程技术的缺点，成为研究重编程机制的重要方法。目的：采用与重庆大学生物工程学院联合设计研发的“基于微流控制技术和低压脉冲电融合技术”的高效细胞电融合芯片，进行小鼠成体细胞和胚胎干细胞的电融合实验，研究所得到的融合细胞的生物学特性、体内外分化潜能以及DNA去甲基化状态等，确定融合细胞是否发生了体细胞重编程，成为多潜能干细胞，并观察融合细胞在视网膜变性微环境下的分化命运。方法及结果：本研究分为四个部分：第一部分高通量细胞电融合实验平台及其研究1、采用“视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室”（以下简称本实验室）设计研发的交错式微电极阵列芯片，构建细胞电融合实验平台。脉冲梯度实验观察脉冲电压对细胞活性的影响后发现，当脉冲电压的幅度≥10V，细胞会因为细胞膜产生不可逆电穿孔而死亡，8V-9V的脉冲电压是细胞膜穿孔最充分，而又不会导致高细胞死亡率的最佳融合电压。2、采用HEK293细胞、NIH3T3细胞及mESC细胞分别实现了同种细胞的排队及电融合；分别转染带不同荧光的病毒，实现异种细胞的排队及电融合实验；在此基础上计算其排队率及融合率，同种细胞两两排队平均率为41%左右，异源细胞两两平均排队率为35%左右；同种细胞排队后的平均融合率为46%左右。异源细胞排队后平均融合率可以达到59%，实现了高效率/高通量细胞电融合。3、采用细胞核型分析对单细胞及融合细胞的染色体数目进行统计分析，NIH3T3细胞染色体数目主要集中在68条，HEK293细胞主要集中在72条，mESC细胞染色体数目为40条。对于融合细胞染色体来说，NIH3T3和HEK293细胞融合后染色体集中在140条左右，为两亲本染色体数目之和。mESC和NIH3T3细胞融合后染色体数目集中在108条左右，为两亲本细胞染色体数目之和。第二部分小鼠成体细胞与胚胎干细胞电融合后的多潜能干细胞研究1、将pZLENU-tagRFP慢病毒成功转染NIH3T3细胞，采用流式细胞仪分选纯化，稳定传代。与带GFP的小鼠胚胎干细胞电融合后，利用融合细胞具有双荧光的特性进行FACS分选并收集，得到的融合细胞后采用干细胞培养体系进行培养，形成类似于胚胎干细胞克隆。2、免疫荧光组化方法发现，融合细胞同时表达Oct4、Nanog、Sox2三种与细胞全能性相关的多潜能标志性基因。体外分化试验中能够采用悬滴培养法获得拟胚体，具有亲本细胞的双荧光特性。体内分化试验中采用裸鼠皮下注射方法，1月后在裸鼠皮下形成畸胎瘤，包膜完整，瘤体相对于胚胎干细胞对照组明显偏大，但两者不存在统计学差异；瘤体具有双荧光表达，可见外胚层来源的原始神经管、鳞状上皮，中胚层来源的脂肪组织、软骨组织，以及内胚层来源的柱状上皮、杯状上皮，形态典型。石蜡免疫组化检测外胚层巢蛋白标记物Nestin、中胚层结蛋白标记物Desmin、内胚层GATA6三种三胚层标志物均为阳性表达。第三部分电融合诱导体细胞重编程机制研究1、采用定量PCR的方法检测融合细胞中干细胞相关基因表达情况，发现融合细胞与mESC一样，表达Oct4、Nanog、Sox2、Lin28四种干细胞基因，所有基因在ES细胞中的相对表达量是最高的，融合细胞次之，NIH3T3细胞最低。Western-blot方法检测发现融合细胞与mESC一样，表达上述四种蛋白。2、甲基化特异性PCR的方法检测Oct4、Nanog基因启动子的甲基化情况，发现融合细胞与mESC相似，Oct4、Nanog启动子为去甲基化状态，但同时也检测到启动子甲基化表达。第四部分融合细胞在视网膜变性微环境中的命运观察1.融合细胞移植至RCS大鼠变性视网膜下腔后无明显免疫排斥反应，移植后1周，在RCS大鼠视网膜内可观察到密集分布的融合细胞，部分移植细胞聚集成团存在；移植后2月，移植细胞散在分布，部分细胞向视网膜内层发生了迁移；移植后3月，未见移植细胞踪迹；3个时间点的细胞存活率存在统计学差异。与同龄Long-Evan’s大鼠相比，其在RCS大鼠视网膜内存活更多。2、移植后1周，RCS大鼠的移植细胞多聚集在注射部位附近，主要分布于视网膜下腔和外核层；移植后2个月，少部分细胞迁移至内核层和神经节细胞层；移植后3个月，视网膜下未发现移植细胞踪迹。在移植细胞区视网膜形态结构完整，HE染色未发现瘤体及异常组织结构形成。3、免疫荧光组化观察移植细胞在移植后1周内，表达PKCα、GFAP、chx10、nestin等神经细胞标记物阳性，PKCα阳性的移植细胞数量较少，GFAP阳性的移植细胞，数量较多，隐约可见突起；chx10阳性移植细胞，数量尚可；nestin阳性的移植细胞，数量较为密集，呈现圆形或者椭圆形。结论：1、本实验室自主研发研制“基于微流控制技术和低压脉冲电融合技术”的交错式微电极阵列芯片具有技术创新性，构建的细胞电融合实验平台对细胞损伤小，控制精度高，易于观察和实现自动化，实现了高通量细胞排队及融合，在融合控制精度及效率等方面都较传统方法有了很大提高。2.首次采用细胞电融合技术系统完成小鼠成体细胞与胚胎干细胞的高通量细胞电融合，融合细胞是具有类似于胚胎干细胞的形态学及生物学特性的多潜能干细胞，证实细胞电融合是实现体细胞重编程的有效方法之一。3、发现细胞电融合可以使体细胞发生Oct4、Nanog基因启动子部分去甲基化，实现了体细胞重编程过程的关键性表观遗传学修饰；电融合方法可以作为研究体细胞重编程机制的重要手段之一。4、首次将融合细胞进行了在体实验研究，融合细胞在变性视网膜微环境下具有存活、迁移及向靶细胞分化特性，无明显免疫排斥反应及成瘤；融合细胞在正常视网膜微环境内不能存活，表明融合细胞移植具有一定的安全性及可行性。本研究为增加干细胞的来源和解决干细胞临床应用中的免疫排斥问题和伦理学问题奠定了基础。