论文部分内容阅读
急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是由各种非心源性严重肺内外因素导致的肺毛细血管弥漫性损伤、通透性增加,进而演变为肺水肿、透明膜形成和肺不张为主要病理学特征的疾病。ALI的主要临床表现为急性进行性加重的呼吸困难和难治性低氧血症,病情进一步恶化后,可形成急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)。ALI/ARDS发病机制的实质是炎症反应的失控而导致弥漫性肺损伤和呼吸功能障碍。在临床上除了保护性机械通气外,目前并没有很好的治疗药物上市,因此开发新型治疗药物或靶点具有非常重要的理论和实际意义。丁苯羟酸是一种已上市多年的非留体抗炎药,对治疗类风湿性关节炎、湿疹和其它多种皮肤炎症等有较好的疗效,但其抗炎的作用机制目前仍不清楚。中性粒细胞趋化是造成急性肺损伤中炎症失控的根本原因,由白三烯A4水解酶(Leukotriene A4 hydrolase,LTA4H)催化生成的白三烯B4(Leukotriene B4,LTB4)是介导中粒细胞趋化的强效趋化因子之一,因此LTA4H抑制剂可以作为急性肺损伤的候选治疗药物。我们通过LTA4H抑制剂高通量筛选平台对已上市药物库进行了筛选,发现丁苯羟酸可以作为一种LTA4H抑制剂,能够有效地抑制LTA4水解为LTB4,从而影响中性粒细胞的趋化,对急性肺损伤起保护作用。本文利用结构生物学和小鼠急性肺损伤模型研究了丁苯羟酸对LTA4H活性的特异性抑制及其抑制作用位点,以及对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用,并从分子水平上验证了丁苯羟酸对急性肺损伤的保护作用与抑制核因子(Nuclear factor κB,NF-κB)信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路中关键蛋白活化的相关性。本论文的主要研究内容和研究结果如下:(1)我们在LTA4H抑制剂高通量筛选平台上对已上市药物库进行筛选,发现丁苯羟酸可以作为一种LTA4H抑制剂,并对LTA4H-Bufexamac复合物晶体结构进行了 X-射线衍射解析。发现丁苯羟酸能与LTA4H的L型狭窄活性口袋结合,即丁苯羟酸的羰基和羟基特异性地与LTA4H的活性位点中的三个关键氨基酸残基(Glu296,Glu318和Tyr383)和Zn2+结合,这一结果为阐明丁苯羟酸特异性抑制LTA4H活性的分子机制提供了证据。(2)利用ELISA法和细胞迁移侵袭试验,检测了丁苯羟酸对中性粒细胞中LTB4合成和对中性粒细胞趋化的影响。发现丁苯羟酸是通过抑制LTA4H进而有效地抑制LTB4的产生和中性粒细胞趋化。(3)建立了脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠急性肺损伤模型,研究了丁苯羟酸对小鼠ALI的保护作用。证明了丁苯羟酸可以抑制LPS诱导ALI的NF-κB的过度活化,并参与阻断MAPK信号通路中三个关键蛋白激酶(p38MAPK、ERK、JNK)的磷酸化,从而对LPS诱导的小鼠急性肺损伤具有保护作用。(4)运用计算机辅助药物设计,对丁苯羟酸的化学结构进行了优化以提高对LTA4H的抑制活性,为进一步的研究工作奠定基础。综上所述,通过对丁苯羟酸抑制LTA4H作用的研究,证明丁苯羟酸对小鼠急性肺损伤具有保护作用;通过对丁苯羟酸抑制LTA4H的作用位点以及丁苯羟酸与急性肺损伤中NF-κB和MAPK信号通路相互作用的研究,阐明了丁苯羟酸对小鼠急性肺损伤保护作用的机制。本文研究结果为将丁苯羟酸开发成一种治疗急性肺损伤的潜在药物提供了依据。