现阶段,针对于RA发病机制特定分子的靶向性治疗或利用靶向性治疗药物针对于不同的RA患者制定特有治疗方案型式已成为一种新的发展趋势。近年来,通过对RA发病机制的深入研究,认识到肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是RA发病的关键致病因子。TNF-α抑制剂类生物制剂通过靶向对抗TNF-α的活性治疗RA已成为RA治疗史上的一个革命性变化,达到临床缓解已成为一个可以实现的治疗目标。近年来国际上针对于靶向性作用于TNF-α治疗RA的生物制剂的研发受到极大地关注,有数种此类已通过临床试验并应用于RA的临床治疗,并且取得了其它抗RA药物所不能替代的治疗效果。更为可喜的是,随着中国生物科技和生物制药技术的迅猛发展,针对于靶向性作用于TNF-α治疗RA的生物制剂在国内相继被研发并应用于临床,给国内RA患者的靶向性治疗提供了更为变利的条件,普遍或全面应用此类药物在国内开展RA治疗已成为可能,但对应用此类药物靶向治疗RA的特有作用机制认识还不够深入,对临床应用的作用效果观察尚缺乏应有的经验,对疗效的判断还没有预测性评估的手段、指标、标准或指南可循。因此,本课题利用体外培养的DRG神经元,研究不同浓度的外源性TNF-α对离子通道型受体瞬时受体电位通道香草醛亚型-1(transient receptor potential vanilloid type 1,TRPV1)和瞬时受体电位锚蛋白 1(transient receptor potential ankyrin 1,TRPA1)表达的影响作用;利用Ⅱ型胶原诱发的炎症反应疼痛大鼠动物模型,研究TNF-a抑制剂安佰诺(anbainuo,ABN)的镇痛作用及其对炎症反应疼痛大鼠DRG神经元TRPV1和TRPA1表达的影响作用,分析TNF-α与TRPV1和TRPA1的致痛作用机制;并利用曾用甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)+其它传统改善病情抗风湿药(conventional disease-modifying antirheumatic drug,cDMARD)疗效不佳并仍处于疾病活动期的RA患者,研究TNF-α抑制剂ABN的抗疼痛作用机制及临床治疗效果,为有效缓解RA患者的疼痛、阻止RA患者的病情进展、为RA患者获得好的预后提供重要的基础实验研究依据和临床治疗证据。第一部分TNF-α刺激与疼痛信号分子TRPV1和TRPA1在DRG神经元表达的关系TNF-α信号系统介导炎症性疼痛的机制是复杂的;TRPV1作为一个兴奋性非选择性阳离子通道不仅能介导神经源性炎症和氧化应激,而且可介导神经损伤所诱发的神经病理性疼痛;TRPA1作为一个兴奋性离子通道,可通过钙离子信号作为细胞的传感器而发挥其功能,成为痛觉和炎症的始动因子和守护因子;在痛觉和炎症信号通路上,TRPV1和TRPA1可感受到很宽范围的促疼痛因子或促炎症反应因子的变化。通过初级传入神经元,TRPV1和TRPA1作为伤害性刺激感觉信息传递的哨兵,传递到中枢神经系统(central nervous system,CNS)而致痛。本课题根据TNF-α的致痛作用以及TRPV1和TRPA1是调控周围痛觉信号传导的重要关键分子的观点,为了进一步阐明TNF-α的致痛作用机制及其与TRPV1和TRPA1在致痛作用中的相互作用关系,本课题利用DRG神经元培养技术,探讨TNF-α作用于神经元后,对TRPV1和TRPA1的影响作用。结果显示,1 ng/ml TNF-α在影响神经元突起向周围延伸方面具有促进效应,而10 ng/ml TNF-α在影响神经元突起向周围延伸方面则显示出其具有抑制效应;1 ng/ml TNF-α使TRPV1和TRPA1阳性神经元比例增加的调控效应显示出其对具有表达TRPV1和TRPA1潜能的DRG神经元启动了这两种受体的表达程序,而10ng/mlTNF-α则显示出TRPV1和TRPA1表达的抑制作用,这可能是随着TNF-α浓度的升高所显现出的其对神经元具有破坏性的一个方面。本课题的研究结果,为进一步探讨靶向性作用于TNF-α进而影响初级传入神经元TRPV1和TRPA1表达或活性在炎症反应的发生和发展中的作用、介导痛觉信息传递的外周机制等方面,提供了可供利用的体外培养模型、相应的体外实验证据和理论基础指导。第二部分安佰诺缓解Ⅱ型胶原诱发的炎症大鼠疼痛的实验研究随着生物制剂的研发和应用,虽然已有靶向性治疗策略在应用,但精确定位的何种状态下进行针对于何种靶点的治疗策略尚难以确定。TNF-α已成为RA生物靶向治疗的重要基础研究、生物制剂研发和临床治疗策略制定的重要的靶向性促炎症反应细胞因子。TNF-α是介导周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)炎症反应的重要标志物之一。TNF-α抑制剂ABN可靶向性抑制TNF-α产生炎症反应的活性,但其否会通过TNF-α信号途径,影响重要的疼痛信号分子TRPV1和TRPA1的表达及其对痛觉信号的传递效能产生影响,目前并不清楚。因此,本课题利用Ⅱ型胶原诱发的炎症反应大鼠动物模型,研究TNF-α抑制剂ABN对Ⅱ型胶原诱发的炎症反应大鼠神经病理性疼痛行为的改善作用,并着重探讨TNF-α抑制剂ABN与Ⅱ型胶原诱发的炎症反应大鼠DRG神经元TRPV1和TRPA1表达之间的关系。结果显示,ABN可改善Ⅱ型胶原诱发的触觉异常性疼痛和热痛觉过敏,并下调因炎症反应导致的TRPV1和TRPA1表达的增加。根据这一结果可以推测,TRPV1和TRPA1可能参与了 Ⅱ型胶原诱发的炎症反应,并且与TNF-α表达上调有关,可以认为靶向抑制TNF-α可使很宽泛的痛觉刺激得到改善,这是TNF-α信号系统作为RA靶向性治疗的有效靶标的重要证据。第三部分安佰诺对活动性类风湿关节炎患者的治疗作用TNF-α抑制剂类生物制剂通过靶向对抗TNF-α的活性治疗RA已成为RA治疗史上的一个革命性变化,达到临床缓解已成为一个可以实现的治疗目标。随着TNF-α抑制剂类生物改善病情抗风湿药(biologic disease-modifying antirheumatic drug,bDMARD)与MTX联合治疗在RA患者中的成功应用,极大地改变了 RA的治疗策略和改善了 RA患者的病情。根据慢性炎症反应是RA疾病引起全身各系统临床表现的主要病因以及促炎症反应细胞因子TNF-α在RA炎症反应发病进程中的关键作用,本课题对曾用MTX+其它cDMARD药物疗效不佳并仍处于疾病活动期的RA患者,应用TNF-α抑制剂ABN与MTX联合治疗,观察了经ABN+MTX治疗后24 w内不同时间点晨僵、关节疼痛和肿胀、健康评价、疼痛模拟标度尺(visual analogue scale,VAS)评分、医生VAS评分、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)以及C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)等各项指标的变化,并与ABN+MTX治疗之前(0 w)的相应数据进行比较。结果显示,ABN与MTX联合治疗具有显著疗效。这一结果表明,ABN通过靶向抑制TNF-α的活性对活动性RA患者具有确切的疗效。