【摘 要】
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柑橘类果树童期长达6-8年,超表达FLOWERING LOCUS T（FT）可以大大缩短柑橘的童期。将超表达FT的转基因拟南芥作为砧木进行嫁接,砧木中的FT蛋白移动到接穗中引起接穗早花。在超表达FT的转基因苹果上嫁接未观察到接穗早花。研究报道含油量极高的麻风树可以诱导嫁接的接穗开花。LIPOYLTRANSFERASE 2（LIP2A）是植物脂肪代谢过程中的调控基因,该基因参与植物体的生长发育过程,
【基金项目】
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国家重大研发计划（2019YFD1000104）； 国家自然科学基金（31972356,31772252,31601743和31872045）；
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柑橘类果树童期长达6-8年,超表达FLOWERING LOCUS T（FT）可以大大缩短柑橘的童期。将超表达FT的转基因拟南芥作为砧木进行嫁接,砧木中的FT蛋白移动到接穗中引起接穗早花。在超表达FT的转基因苹果上嫁接未观察到接穗早花。研究报道含油量极高的麻风树可以诱导嫁接的接穗开花。LIPOYLTRANSFERASE 2（LIP2A）是植物脂肪代谢过程中的调控基因,该基因参与植物体的生长发育过程,并且在抵御环境胁迫过程中也发挥着重要作用。研究发现脂质体能够调控FT蛋白的移动并且FT能特异结合脂类物质,然而对于柑橘中LIP2A基因的功能及其与FT的关系尚未被阐明。本课题从克里曼丁橘中克隆出CcLIP2A,并对其进行了功能分析,以探讨CcLIP2A在柑橘成花中的作用及其与FT之间的联系。主要工作及试验结果如下:1.CcLIP2A编码1个油脂蛋白结构域,系统进化树分析显示柑橘LIP2A基因高度保守。2.将35S:CcLIP2A-EGFP和35S:CcLIP2A-RFP-PtFT-EGFP超表达载体瞬时转化本氏烟草,亚细胞定位结果显示CcLIP2A蛋白分布于内质网,且CcLIP2A与PtFT在膜上共表达。以柑橘不同器官的c DNA为模板进行q RT-PCR实验,发现CcLIP2A在柑橘的茎和花中表达量较高。3.在野生型拟南芥中异位超表达CcLIP2A出现早花表型,统计结果显示T2代转基因拟南芥莲座叶片数显著减少,开花时间显著提前。将35S:CcLIP2A-RFP-PtFT-EGFP稳定转化野生型拟南芥,结果显示T1代转基因系与35S:PtFT转基因拟南芥的开花时间没有显著差异。4.对野生柠檬进行0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h和48 h的4℃冷处理,定量分析结果表明CcLIP2A响应低温。同时,对CcLIP2A基因的VIGS柠檬苗进行-4℃冰冻处理,结果发现沉默系比野生型柠檬对低温更敏感。5.构建pGBKT7-CcLIP2A和pGADT7-CcLIP2A载体,进行CcLIP2A与PtFT的酵母双杂交实验,结果显示四缺培养基不长斑。构建pET32a-CcLIP2A载体与PtFT蛋白进行Pull-down实验,结果显示无互作蛋白条带。这两个实验均表明PtFT与CcLIP2A体外不互作。进一步构建了35S:CcLIP2A-FLAG和35S:PtFT-HA载体进行CO-IP实验,结果表明PtFT与CcLIP2A体内也不互作。综上所述,在野生型拟南芥中超表达CcLIP2A基因出现早花表型,因此CcLIP2A基因可能参与柑橘成花的调控过程。通过酵母双杂、Pull-down和CO-IP实验分析出CcLIP2A与PtFT不存在互作关系。因此CcLIP2A不是通过与FT蛋白相互作用来参与成花途径,其具体作用机理还需要进一步的探索。另外,CcLIP2A可能在柑橘的抗冷胁迫过程中起作用。
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