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我国拥有丰富的粟类资源,以谷子为主的粟类作物曾是我国餐桌上的主粮,且粟谷蛋白衍生的生物活性肽在氧化应激及炎症相关的慢性疾病防治中具有重要作用。发芽是提高谷物营养价值并释放生物活性肽的一种经济可行的加工方式,但发芽的谷物仍是一种生原料,在食用之前需要加热熟化,同时,热处理也是一种释放生物活性肽的可行方法。此外,胃肠消化是食物蛋白转化为人体营养素不可避免的过程且对食源性生物活性肽具有重要作用。然而,发芽和加热(煮制和微波)对粟谷蛋白中抗氧化和抗炎肽的潜在作用尚不清楚。本研究采用国际标准化的体外静态胃肠道消化模型,研究发芽和热处理粟谷蛋白经胃肠消化后,是否会释放出对氧化应激和炎症具有积极作用的生物活性肽。本论文研究分四个部分,主要包括:①基于化学方法筛选粟谷和粟芽蛋白消化产物最高活性的超滤、液相组分;②基于细胞学方法探讨发芽和热加工对粟谷蛋白消化产物液相分离亚组分活性的影响;③粟谷和粟芽蛋白消化产物液相分离亚组分吸收转运能力的评估;④粟谷和粟芽蛋白消化产物中活性最高液相分离亚组分的结构鉴定。主要研究方法、结果与结论如下。1.采用四种抗氧化测定化学方法(ABTS自由基清除能力、氧自由基吸收能力、亚铁离子螯合能力及铁离子还原能力)和两种抗炎作用测定化学方法(一氧化氮生成抑制率、BSA变性抑制率)对粟谷和粟芽蛋白消化产物超滤组分(>10 kDa,3-10 kDa,和<3 kDa)进行筛选,研究发现不同抗氧化测定方法得到的结果不同,其中ABTS清除能力与氧自由基吸收能力结果相似,均显示<3 kDa组分具有较强的自由基清除能力。然而,螯合能力则与还原能力趋势相反,其中<3 kDa组分具有较强螯合能力,而>10 kDa组分则具有最高的还原能力。另外,两种抗炎方法均显示<3 kDa组分具有较强的抑制率。因此,选取<3 kDa组分作为抗氧化和抗炎作用最强组分进一步分离。2.采用RP-HPLC对粟谷和粟芽蛋白消化产物<3 kDa组分进一步分离纯化,根据流出时间依次得到四个液相分离亚组分(F1、F2、F3、F4),再次利用相同的四种抗氧化测定化学方法和两种抗炎作用测定化学方法对粟谷和粟芽蛋白消化产物液相分离亚组分进行筛选,结果发现不同抗氧化测定方法均显示F4组分具有最高抗氧化活性,不同的抗炎测定方法也显示F4组分具有最高的抗炎作用。因此,选取F4液相分离亚组分进一步利用细胞实验评估其抗氧化与抗炎能力。3.采用过氧化氢诱导的Caco-2细胞氧化应激模型探索不同加工处理粟谷和粟芽的F4组分的抗氧化活性,结果发现过氧化氢导致细胞活性下降至70.84±1.94%,使细胞内ROS升高至140.71±8.32%,GSH含量由90.17±2.47降低至66.73±0.18μmol/g 蛋白质,SOD 活性由 0.28±0.05 降低至 0.17±0.02 U/mg 蛋白质。然而,热处理,尤其是煮制处理的粟芽会增加ROS含量并减少GSH含量和SOD活性,从而降低抗氧化活性。而发芽之后会增加ROS的产生,但提高GSH含量和SOD活性。由此提示,发芽对粟谷蛋白Caco-2细胞氧化应激的作用并不明确,但所有粟谷和粟芽蛋白消化产物液相亚组分F4均显示出抗氧化活性。4.采用脂多糖介导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型探索不同热处理粟谷和粟芽的F4组分的抗炎作用,结果发现脂多糖导致NO含量从4.43±0.07提高至24.22±0.56 μM,TNF-α 含量由 68.11±2.30 升高至 138.06±2.19 ng/mL,IL-6 含量由 119.64±6.88 提高至 418.79±19.91 pg/mL,PGE2 含量由 18.94±0.54 提高至21.18±0.34 pg/mL。然而,煮制处理粟谷和粟芽可降低RAW264.7细胞上清液中NO、IL-6、TNF-α含量,从而增强液相分离亚组分F4的抗炎活性。而发芽、微波处理对抗炎作用并不清楚,因为与粟谷相比,粟芽能提高NO和TNF-α但降低IL-6的含量,而微波处理的效果则与发芽相反。此外,所有粟谷和粟芽蛋白消化产物液相亚组分F4均不能抑制PGE2的产生。因此,选取煮制粟谷和煮制粟芽的F4组分进行进一步的结构鉴定。5.利用Caco-2细胞单层模型评估粟谷和粟芽蛋白F4液相分离亚组分的吸收转运能力,结果发现不同处理粟谷和粟芽的F4组分4 h内的表观渗透系数(Papp)随着转运时间的延长而逐渐减小,转运4h时其Papp值在4×10-5 cm/s左右,均大于2×10-6 cm/s,说明所有F4组分均具有良好的吸收转运能力。6.利用LC-MS/MS对活性最高的F4液相分离亚组分(煮制粟谷和煮制粟芽)进行肽序列鉴定,结果发现,煮制粟谷F4组分中鉴定出11种肽序列,其中大多数肽序列中含甘氨酸残基(G),煮制粟芽F4组分中鉴定出7种肽序列,大多数肽序列具有谷氨酸(E)和天冬氨酸残基(D)。7.本研究通过模拟粟谷及粟芽食用过程,即生原料-熟化-消化,利用化学方法和细胞学方法评价其生物活性,初步表明了在该过程中粟谷和粟芽蛋白可能发挥抗氧化、抗炎作用,并确定煮制是该过程中的最适熟化方式,进而鉴定出了煮制粟谷中可能发挥作用的肽序列 MAAAFSL、AVWCYLRF、AMDAGGGGSGSGQL、IINEPTAAAIAYGLDK、ISGLIYEETR、AMLEGKSEPECK、AVFPSIVGRPR、MGGGGGGAGR、GGGDDDDDADK、MMGDSTYR、KLSIIISK及煮制粟芽中可能发挥作用的肽序列SEDDPFD、REEGVLIF、EAGNKGTLSF、MGPIPSTL、EDDQMDPMAK、QNWDFCEAWEPCF、MSHRGACGCEK。其中,粟谷中的甘氨酸残基(G)与粟芽中谷氨酸(E)和天冬氨酸残基(D)可能发挥关键作用。因此,本研究可以为粟谷及粟芽生物活性肽的开发及其熟化方式的选择提供科学依据,有利于促进粟谷资源的合理、高值化利用。