睡莲花总黄酮及其成分对HSC细胞增殖活化的影响及其机制研究

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目的:研究睡莲花总黄酮(NCE)及其成分烟花苷(NCE-1)和睡莲酚(NCE-2)对H2O2致正常肝细胞(LO2)损伤的保护作用及其对肝星状细胞(HSC)增殖、活化的影响,并进一步探讨其对TGF-β1诱导的HSC细胞增殖活化的影响及机制。方法:1)通过MTT法检测NCE及其成分NCE-1和NCE-2对LO2细胞分别作用24、48和72h后的毒性。0.6mmol·L-1H2O2处理LO2细胞4h构建H2O2损伤LO2细胞模型。用含不同浓度样品的培养液干预损伤肝细胞并通过MTT法测定细胞活力,检测细胞上清液AST、ALT、MDA、SOD和NO水平,评价NCE、NCE-1和NCE-2对肝细胞损伤的保护作用。2)通过MTT法检测NCE(终浓度分别为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μg/mL)、NCE-1(终浓度分别为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μg/mL)和NCE-2(终浓度分别为2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0μg/mL)对HSC细胞增殖的影响,计算半数抑制率(IC50);生化法检测细胞上清液LDH、Hyp含量;ELISA法检测细胞上清液Ⅰ-Col、?-SMA水平;流式细胞仪检测细胞凋亡和周期的变化。3)通过MTT法检测NCE、NCE-1和NCE-2对TGF-β1诱导HSC细胞增殖的影响;ELISA法检测Ⅰ-Col、?-SMA含量及Smad2、Smad3、Smad7蛋白的表达水平;流式细胞仪测定其对TGF-β1刺激HSC后细胞凋亡和周期的影响。结果:1)给药24、48和72h后,NCE、NCE-1和NCE-2分别在6.25~12.50μg/mL、6.25~100.00μg/mL、6.25~25.00μg/mL的浓度范围内对正常人肝细胞(LO2)无毒性作用,细胞的存活率达到90%以上,且在该范围内可显著抑制H2O2对LO2细胞造成的损伤,细胞活力得到了明显提高(P<0.05),并能显著降低H2O2致急性损伤肝细胞的ALT、AST、MDA和NO水平,提高SOD活力,差异有统计学意义(P<0.05)。2)MTT实验结果表明,NCE、NCE-1和NCE-2可显著抑制HSC细胞的增殖,且呈明显的量效关系;不同剂量的NCE(3.125、6.25、12.50μg/mL)、NCE-1(12.5.00、25.00、50.00、100.00μg/mL)和NCE-2(5.00、10.00、20.00μg/mL)对细胞分泌Hyp具有显著的抑制作用(P<0.05);对HSC细胞内Col-1、α-SMA的表达具有显著的抑制作用(P<0.01)。高剂量的NCE-1(100.00μg/mL)还对HSC细胞的凋亡具有较为显著的诱导作用(P<0.05)。3)实验结果表明,NCE(3.125、6.25、12.50μg/mL)、NCE-1(12.5.00、25.00、50.00、100.00μg/mL)和NCE-2(5.00、10.00、20.00μg/mL)可显著抑制TGF-β1诱导HSC的增殖,且呈明显的量效关系(P<0.01);NCE、NCE-1和NCE-2对TGF-β1诱导HSC细胞的Col-1、α-SMA、Smad2及Smad3的蛋白表达也具有显著的抑制作用,能上调smad7的蛋白表达(P<0.01)。结论:睡莲花总黄酮及其成分烟花苷和睡莲酚体外给药对氧化应激致肝细胞损伤有保护作用;并可抑制HSC的活化增殖及TGF-β1诱导HSC的增殖,对肝纤维化有潜在的防治作用,其机制可能与促进细胞凋亡、抑制细胞外基质合成及干预TGF-β1/Smad信号通路有关;同时也揭示了烟花苷和睡莲酚是睡莲花总黄酮发挥抗肝纤维化药效的物质基础。
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