CRIP在文蛤与方形网纹溞发育过程中的功能

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文蛤和方形网纹溞都是水产上十分重要的动物,前者是我国重要的经济品种之一,后者常作为鱼类的活体饵料。这两种生物都很少用于分子生物学的研究。本研究利用分子生物学手段研究了这2种无脊椎动物的富含半胱氨酸小肠蛋白(Cysteine-rich intestinalprotein, CRIP)基因,初步探讨了CRIP在它们体内的生物学功能。本研究分为2个部分。第1部分对文蛤的CRIP基因的克隆与功能展开研究,具体的研究结果如下:(1)克隆了文蛤的CRIP的cDNA序列,长度为468bp,其中ORF237bp,5’非翻译区83bp,3’非翻译区148bp。(2)对MmCRIP(Meretrix meretrix cysteine-rich intestinal protein)进行生物信息学分析。MmCRIP编码一条由78个氨基酸残基组成的多肽,分子式为C379H578N106O110S8,理论分子量为8635.8。其中富含Lys(13.92%)、Gly(11.39%)和Cys(8.86%),缺乏Gln、Ile。含有负电氨基酸残基7个,正电氨基酸残基13个,等电点为9.01,属于阳离子多肽。MmCRIP具有CRIP亚家族特征性结构域——LIM结构域。蛋白三维结构预测其在碳末端和氮末端分别形成α-螺旋与连续的两个β-折叠。(3)利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测了MmCRIP在不同发育阶段、不同组织中mRNA的表达差异。结果显示,担轮幼虫和D型幼虫阶段MmCRIP表达量较低,而在从D型幼虫变态成壳顶幼虫时表达量升高,后者是前者的3.5倍。此外,在壳顶幼虫到稚贝的发育过程中MmCRIP表达量略有下降。在不同组织中,肌肉中MmCRIP的表达量最高(P≤0.05,n=3)。(4)利用qPCR技术检测MmCRIP受鳗弧菌刺激后mRNA表达量的变化。结果表明菌刺激前后MmCRIP表达量保持稳定。(5)用不同浓度MmCRIP的双链RNA(dsRNA)对文蛤D型幼虫进行RNA干扰。结果发现0.1、1.0、10μg/mL dsRNA处理组死亡率均显著高于对照组(P≤0.01, n=6)。处理浓度越大的dsRNA,使得D型幼虫存活数目下降得越快。三个浓度的处理组均在处理48h后,死亡率接近100%。结论是,认为MmCRIP可能参与文蛤从D型幼虫到壳顶幼虫的发育过程。MmCRIP在成贝肌肉组织中有高表达,提示其可能主要在肌肉组织中发挥重要生理功能。第二部分的内容是方形网纹溞的CqCRIP基因的克隆和功能分析,具体的研究结果如下:(1)克隆了方形网纹溞的CRIP的cDNA序列,长度为693bp,其中ORF237bp,3’非翻译区456bp。(2)对CqCRIP(Ceriodaphnia quadrangula cysteine-rich intestinal protein)进行生物信息学分析。 CqCRIP所编码多肽由78个氨基酸残基组成,分子式为C378H576N110O108S8,理论分子量为8645.8。其中富含Lys(12.66%)、Gly(11.39%)和Cys(8.86%),缺乏Ile。含有负电氨基酸残基6个,正电氨基酸残基12个,等电点为9.04,属于阳离子多肽,同MmCRIP一样具有CRIP家族所拥有的LIM结构域。蛋白三维结构预测,亦在碳末端和氮末端分别形成α-螺旋与连续的两个β-折叠。基于CRIP氨基酸序列构建的系统进化树显示,MmCRIP与CqCRIP与无脊椎动物CRIP聚类在一起。(3)利用qPCR检测CqCRIP在不同发育阶段mRNA的表达差异。结果显示各龄期的表达量基本恒定,但在食物趋于短缺、水质下降的环境下产生的雄体中CqCRIP的mRNA表达量显著地大于雌体(P≤0.01,n=3);产休眠卵的雌体的表达量大于正常孤雌生殖雌体(P≤0.05,n=3)。(4)用含有CqCRIP dsRNA的HT115菌投喂方形网纹溞,死亡率相较于对照显著上升(P≤0.05,n=3),尤其是60-72h时为极显著(P≤0.01,n=3)。但84h后总死亡率不大于50%。结论是,认为CqCRIP可能与方形网纹溞的生殖方式转换相关,是参与生命活动的重要因子。CRIP在不同的生物具有不同的功能,而这些功能则需要更进一步的研究得以细致的阐述。
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