自从1997年Yin等报道了CD133分子（当时命名为AC133抗原，现又称人类Prominin-1）以来，该分子已成为干细胞研究的热点。CD133分子已成为分离、鉴定包括造血系统和中枢神经系统等不同组织来源干细胞的新的表面标记之一。人CD133基因编码由865个氨基酸组成的五跨膜（5TM）糖蛋白，总分子量为120KDa。CD133分子的转录由5个不同的启动子控制，导致至少有12个CD133异构体剪接形成，每个异构体以组织特异性方式表达，并受甲基化状态调控。CD133基因的不同剪接本产生不同的CD133异构体已经逐步得以鉴定。CD133在分子量和蛋白结构上与已知的4TM和7TM受体家族成员不同，提示CD133是5TM受体超家族中的一个新成员。同时CD133的分子结构和蛋白表达提示它可能作为一种生长因子受体而起作用，并参与细胞间信号传递。 CD133 mRNA在成人多个系统组织中表达，CD133蛋白表达在正常的造血干祖细胞和胚胎神经上皮细胞，以及一些肿瘤细胞。体外实验显示，CD133+肿瘤细胞具有自我更新、增殖和多系分化等肿瘤干细胞（CSC）特征，越来越多的证据表明，CD133分子是人类肿瘤干细胞（CSC）标志物之一，这提示CD133+肿瘤细胞代表了独特的CSC群体，CD133分子可能成为新的肿瘤治疗的靶点。但是CD133分子是否参与肿瘤干细胞的失控性增殖和自我更新尚待进一步研究。CD133相对应的配体分子及其细胞内与之相互作用的下游通路分子目前均不明确，而且对CD133分子的研究缺乏有效的实验手段。鉴此，研制抗人CD133功能性单克隆抗体将拓展对CD133分子的研究，也为肿瘤干细胞研究和生物治疗提供新的途径。 本研究首先克隆了人CD133基因，和构建了稳定表达CD133的转基因细胞，继而成功地研制了两株鼠抗人CD133单克隆抗体，并对其生物学特性进行了初步分析。在此基础上，探讨了CD133分子在肿瘤细胞的表达及其对人单核细胞白血病细胞株SHI-1的生物学效应。 一、人CD133基因的克隆、基因转染细胞株的构建以及抗人CD133单克隆抗体的研制。 目的：克隆人CD133编码区全长基因，构建能稳定表达人CD133分子的基因转染细胞株，进而以此为免疫原研制抗人CD133单克隆抗体。 方法：以AC133-2抗原的基因序列为模板，通过重叠延伸PCR法克隆人CD133编码区全长基因，并进行测序验证；获得的CD133编码区全长基因经Hind-Ⅲ和BamH-Ⅰ双酶切后插入真核表达载体pIRES2-EGFP中，构建成重组pIRES2-EGFP/CD133。采用脂质体法将重组pIRES2-EGFP/ CD133质粒转染L929细胞，用G418抗生素筛选获得稳定表达CD133的基因转染细胞；流式细胞术分析报告基因GFP的表达及CD133分子在基因转染细胞膜上的表达。以表达人CD133分子的基因转染细胞L929/ CD133为免疫原，常规免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，并以表达CD133分子的视网膜母细胞瘤细胞株WERI-RB-Ⅰ和L929/mock分别流式筛选阳性、阴性杂交瘤克隆，经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养，获得2个特异性分泌鼠抗人CD133分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用细胞核染色体计数、Ig亚型快速定性试纸法、竞争结合抑制等实验，对获得的杂交瘤细胞株及单克隆抗体进行初步的生物学特性的鉴定。 结果： （1）成功地克隆了人CD133编码区全长基因，针对CD133编码区全长基因构建的重组质粒经双酶切后，能够释放出2600bp左右的目的基因片段，DNA测序进一步证明插入载体中的基因片段与CD133基因的序列完全一致。 （2）获得G418抗生素耐药的CD133基因转染细胞，流式细胞仪检测表明，GFP报告基因在基因转染细胞L929/CD133高表达，同时CD133基因转染的L929细胞膜上能稳定表达人CD133蛋白。 （3）成功获得2株持续和稳定分泌鼠抗人CD133单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为14D7和10G11。杂交瘤细胞核型分析显示，杂交瘤细胞株的染色体数目在100条以上，超过小鼠B细胞和SP2/0细胞的染色体数，表明为融合体；经过快速定性试纸分析显示，2株单抗轻链均为κ链，14D7重链为IgG2a亚类，而10G11重链为IgG2b亚类；单抗识别的抗原表位分析结果表明，单抗10G11对商品化的抗CD133单抗AC141与CD133的结合产生部分竞争抑制作用；而14D7对AC141与CD133的结合无竞争作用，14D7和10G11之间没有竞争作用，由此表明，研制的2株抗人CD133单抗14D7和10G11与商品化抗CD133单抗AC141识别的位点不完全相同。 结论：成功构建了稳定高表达人CD133分子的基因转染细胞，为研制抗人CD133单克隆抗体提供了有效的免疫原。成功获得2株稳定分泌特异性鼠抗人CD133单抗的杂交瘤细胞株，这2株单抗与商品化抗人CD133单抗识别CD133抗原的不完全相同位点。 二、鼠抗人CD133单克隆抗体的生物学特性及其对人单核细胞白血病细胞系SHI-1的体外生物学效应。 目的：分析人CD133分子在肿瘤细胞上的表达，并对其生物学特性进行初步分析，观察单抗对表达CD133的人单核细胞白血病细胞系SHI-1的体外生物学作用，为抗CD133单抗用于肿瘤干细胞研究提供实验依据。 方法：采用间接免疫荧光法分析单抗对不同来源人肿瘤细胞株、人胚前脑永生化神经前体细胞（hSN12W-TERT）以及正常入骨髓细胞和外周血单个核细胞的识别作用；免疫组织化学方法分析儿童髓母细胞瘤、胎盘组织CD133分子的表达。研究CD133单克隆抗体14D7对SHI-1的体外生物学效应，包括：细胞形态的动态观察、活细胞计数和MTT法分析SHI-1的增殖；PI染色和流式细胞仪分析SHI-1细胞的周期分布；Annexin V/PI染色和流式细胞仪检测细胞凋亡；进一步流式细胞仪分析单抗刺激前后SHI-1细胞CD95/CD95L、CD14以及PD-L1、PD-1、B7-H3等分子表达的改变。 结果： （1）2株单抗的免疫荧光标记和流式分析显示，白血病来源的细胞株U937、SHI-1、肠上皮来源的Caco-2、视网膜母细胞瘤WERI-RB-Ⅰ和Y79表达人CD133分子，正常入骨髓细胞有CD133的低表达；人胚前脑永生化神经前体细胞（hSN12W-TERT）高表达人CD133分子。 （2）2株抗体的免疫组织化学染色法也显示，成人胎盘和儿童髓母细胞瘤表达CD133。 （3）单抗14D7加入SHI-1细胞体外培养后形态观察显示，细胞数量逐步减少，细胞呈不规则型，胞体固缩，出现较多细胞碎片；活细胞计数法和MTT法结果表明，单抗14D7能明显抑制SHI-1细胞增殖，并呈剂量和时间依赖性效应；Annexin V/PI染色显示，单抗14D7作用后，细胞呈现凋亡和细胞周期的G1/S期阻滞；免疫荧兆标记和流式细胞术分析显示，单抗14D7作用后12h，SHI-1细胞表面CD95和CD95L分子均上调表达，免疫协同抑制分子PD-L1、PD-1、B7-H3表达下调，而分化抗原CD14亦呈一过性表达下调（刺激后18-24h最显著）。 结论：使用本实验研制的2株单克隆抗体免疫荧光标记和流式细胞分析显示，CD133分子在一些肿瘤细胞株表达。免疫组化分析表明CD133分子表达在成人胎盘和儿童髓母细胞瘤，由此提示所获得的2株特异性单抗不仅可以作流式分析，而且还可以用于免疫组化分析。单抗14D7通过作用于SHI-1细胞表达的CD133分子，诱导SHI-1细胞周期的G1/S期阻滞，抑制SHI-1细胞增殖，通过活化CD95/CD95L途径促发凋亡性细胞死亡，同时还下调协同抑制分子PD-L1、PD-1和B7-H3的表达，由此表明：本实验所研制的特异性抗人CD133单抗14D7是一株CD133的功能性抗体，将为研究CD133的生物学功能和肿瘤干细胞提供新的手段。 小结： （1）克隆获得人CD133编码区的全长基因，构建了基因转染细胞株L929/CD133。 （2）以L929/CD133为免疫原免疫小鼠研制获得2株特异性鼠抗人CD133单克隆抗体14D7和10G11。 （3）以研制获得的单克隆抗体为手段，分析了人CD133分子在多种肿瘤细胞株、神经干细胞株以及正常或肿瘤组织上的表达特性，通过体外实验重点探讨了CD133单克隆抗体对高表达CD133分子的人类M4型白血病细胞株SHI-1细胞的生物学效应和机制，发现14D7能介导SHI-1细胞的凋亡和细胞周期阻断，从而抑制SHI-1细胞的体外生长。2株新型抗人CD133单克隆抗体在干细胞和肿瘤干细胞研究和应用中具有重要的价值。