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结肠癌是人类高发恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康,结肠癌的有效防治已经成为全球关注的热点。结肠癌的发病与饮食、遗传、运动不足、吸烟饮酒及慢性结肠直肠疾病等多种因素有关,其中饮食是最重要的影响因素。乳酸菌胞外多糖被证实具有免疫调节、抗肿瘤等生物活性,但是对于乳酸菌胞外多糖诱导结肠癌细胞凋亡的相关机制很少报道。因此,本课题采用实验室自行分离得到的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei subp.paracasei M5(L.paracasei M5),发酵提取胞外多糖,并通过与结肠癌HT-29细胞共同培养来研究其诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的作用及机制。(1)提取由本实验室分离鉴定得到的Lactobacillus paracasei subp.paracasei M5,Lactobacillus paracasei subp.paracasei X12,Lactobacillus coryniformis subp.torquens T3等三株乳酸菌的胞外多糖,通过MTT实验结果可知Lactobacillus paracasei subp.paracasei M5胞外多糖(M5-EPS)的抑制作用最佳,用于后续研究;500μg/m L和1000μg/m L的M5-EPS作用于HT-29细胞48 h时抑制效果最好;随后将M5-EPS的发酵条件进行优化,当p H值为6.5,菌液浓度为108 CFU/m L,发酵温度为37°C,发酵时间为12 h时,最终得到的M5-EPS量最多;倒置显微镜下直接观察M5-EPS处理后的HT-29细胞,与对照组相比,数目明显减少,说明M5-EPS可明显抑制HT-29细胞的生长;Hoechst 33258荧光染料对HT-29细胞进行染色发现M5-EPS可以导致HT-29细胞形态变化;通过透射电镜观察M5-EPS处理之后HT-29细胞的超微结构,结果显示HT-29细胞出现了明显的凋亡特征,如细胞质不均匀,内部细胞器紊乱,内质网发生了严重的肿胀;最后,通过流式细胞仪测定HT-29细胞的周期,表明M5-EPS可通过G0/G1的阻滞起到抑制细胞增殖的作用。(2)M5-EPS可以破坏HT-29细胞内部氧化系统的平衡:采用荧光标记法以及流式细胞术检测HT-29细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,结果显示和对照组相比,M5-EPS处理组可明显的提高细胞内ROS水平,且呈现浓度依赖性;从基因角度,通过RT-PCR的手段得知M5-EPS可以显著的降低HT-29细胞内SOD、CAT和GSH-PX等抗氧化酶基因表达水平;从蛋白水平检测SOD、CAT和GSH-PX等酶活力,最终结果与PCR结果相一致;通过N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)抑制细胞内氧化应激后,倒置显微镜下观察,与M5-EPS直接处理相比,可以明显增加HT-29细胞数目,细胞生长形态良好。综上所述,氧化应激途径参与M5-EPS诱导HT-29细胞凋亡的过程,通过提高HT-29细胞ROS水平,并降低抗氧化酶活性致使细胞氧化系统失衡来抑制HT-29细胞的生长。(3)M5-EPS可以通过激活内质网应激途径,影响HT-29细胞的生长:流式细胞仪检测M5-EPS处理后,HT-29细胞内钙网蛋白(CRT)量增加,这说明可能启动内质网应激通路;M5-EPS可以显著的提高HT-29细胞内内质网应激因子GRP78、ATF4和CHOP m RNA的表达量,且基本呈现浓度依赖性;测定与凋亡相关的因子,结果显示M5-EPS能够显著的提高促凋亡因子caspase-3、Bax和Bad基因的表达,显著降低抗凋亡因子Bcl-xl基因的表达;经过NAC处理后,检测细胞内ROS的变化,与M5-EPS直接处理相比荧光强度明显降低,说明氧化应激途径受到抑制;RT-PCR法检测氧化应激途径抑制之后细胞内GRP78和CHOP m RNA的表达量,内质网因子表达量都显著降低,表明氧化应激可以影响内质网应激途径的激活。