【摘 要】
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研究背景和目的:神经病理痛是众所周知的难治性疾病。外周神经损伤后初级感觉神经元分子和细胞的改变在神经病理痛的发病机制中发挥着重要作用。三磷酸腺苷（ATP）可作用于背根神经节（DRG）伤害性感受神经元P2X3受体参与神经病理痛。许多研究表明长非编码RNA（lnc RNAs）具有调节基因表达的功能,lnc RNAs的异常表达可能与人类神经系统疾病有关,然而其详细的作用机制仍不清楚。前期实验发现lnc
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研究背景和目的:神经病理痛是众所周知的难治性疾病。外周神经损伤后初级感觉神经元分子和细胞的改变在神经病理痛的发病机制中发挥着重要作用。三磷酸腺苷（ATP）可作用于背根神经节（DRG）伤害性感受神经元P2X3受体参与神经病理痛。许多研究表明长非编码RNA（lnc RNAs）具有调节基因表达的功能,lnc RNAs的异常表达可能与人类神经系统疾病有关,然而其详细的作用机制仍不清楚。前期实验发现lnc RNA MRAK009713在慢性压迫性神经损伤（CCI）大鼠表达显著升高。本研究旨在通过MRAK009713 siRNA下调CCI大鼠MRAK009713的表达以及通过向正常大鼠中转染MRAK009713全长质粒过表达MRAK009713来观察MRAK009713对P2X3受体介导的神经病理痛的影响及可能机理。通过RNA免疫沉淀（RIP）实验研究与MRAK009713相互作用的蛋白,以期寻找防治慢性神经病理痛的新方法。方法:MRAK009713小干扰RNA（MRAK009713 siRNA）对CCI大鼠的影响:将大鼠随机分为假手术组（Sham）、慢性压迫性神经损伤组（CCI）、CCI转染乱序siRNA组（CCI+NCsiRNA）和CCI转染MRAK009713 siRNA组（CCI+MRAK009713 siRNA）。手术后第七天,CCI+MRAK009713 siRNA组和CCI+NCsiRNA大鼠经鞘内注射MRAK009713 siRNA或MRAK009713 NCsiRNA混合物,剂量为0.25 OD siRNA/20μl/rat。原位杂交（ISH）和实时定量PCR（q PCR）技术检测大鼠DRG中MRAK009713的表达。行为学检测各组大鼠热刺激缩足反应潜伏期（TWL）和机械刺激缩足反应阈值（MWT）。q PCR、蛋白印迹（WB）和免疫组织化学（IHC）检测P2RX3受体表达。WB检测ERK1/2及其磷酸化水平。全细胞膜片钳技术记录假手术组和CCI组大鼠DRG神经元α,β-me ATP（10μM）-激活电流,同时记录单独转染p EGFP-C1-P2RX3质粒和共转染p EGFP-C1-P2RX3质粒与MRAK009713 siRNA的HEK293细胞的ATP（100μM）-激活电流。MRAK009713过表达对正常大鼠的影响:将大鼠随机分为对照组（Ctrl）、转染pc DNA3.1-MRAK009713全长质粒的实验组（Ctrl+MRAK009713）和转染pc DNA3.1空载质粒的阴性对照组（Ctrl+vector）。观察七天后,Ctrl+MRAK009713组和Ctrl+vector组分别鞘内注射pc DNA3.1-MRAK009713全长质粒和pc DNA3.1空载质粒,剂量为5μg/20μl/rat。转染7天后,q PCR检测DRG中MRAK009713的表达,行为学检测各组大鼠TWL和MWT。q PCR、WB和IHC检测P2X3受体的表达。WB检测ERK1/2及其磷酸化水平。RNA蛋白质免疫共沉淀技术（RIP）检测MRAK009713和P2X3受体的相互作用。结果:原位杂交结果显示MRAK009713位于DRG神经元胞浆中,且CCI组的表达明显高于假手术组p0.05）;但CCI组p-ERK1/2与ERK1/2的积分光密度比值较假手术组高3.44倍（p0.05）;但Ctrl+MRAK009713组p-ERK1/2与ERK1/2的积分光密度比值明显高于正常组（p0.05）。RNA蛋白质免疫共沉淀（RIP）结果显示MRAK009713可与多种蛋白质产生相互作用,蛋白印迹检测RIP产物结果显示共转染pc DNA3.0-MRAK009713-12×MS2bs和pc DNA3.0-Flag-2×MS2质粒的PC12细胞有P2X3表达,而共转染pc DNA3.0-12×MS2bs和pc DNA3.0-Flag-2×MS2质粒的PC12细胞未检测到P2X3表达。结论:lnc RNA MRAK009713可通过对P2X3的调节影响DRG P2X3受体介导的慢性神经病理痛的痛觉传递过程。
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