目的:随着现代社会大型交通工具发展,创伤性颅脑损伤(Traumatic brain inj ury,TBI)发生率逐渐增高,严重影响人们工作生活,社会影响巨大。最大限度地提高脑外伤后恢复的程度是神经外科目前临床工作努力地方向,因而探索脑创伤后神经血管单元的修复机制一直是脑外伤研究的难点和重点。近期有研究者发现神经元可以释放并转移受损的线粒体到神经元周围星形胶质细胞内被进一步处理。除此外也有报道星形胶质细胞也可以释放含有功能线粒体的囊泡进入受损神经元,促进神经元的修复。但该项研究的研究者也同时表示,因为含有线粒体囊泡不仅含有DNA、RNA等遗传物质,还含有某些重要蛋白质,所以该研究并不能完全证实线粒体本身单独的作用。因此我们设计了本课题,用以研究纯化后脑源性线粒体能否被某些脑内细胞再次摄取并利用,从而改善受体细胞的能量代谢及其相应功能,并且据此我们推测这种交换线粒体的能力可能代表着中枢神经系统内部细胞间能量传递的一种潜在模式。进而为我们寻找脑创伤后神经血管功能修复提供了一条崭新的思路。方法:(1)我们采用国际通用且稳定的胶质细胞瘤化细胞系(C6)探索其可否释放含有线粒体的囊泡,以及囊泡的功能。进一步分离细胞系来源线粒体。(2)由于细胞系来源线粒体数量有限,我们利用新鲜鼠脑分离具有活性的正常功能线粒体,通过nanosight及流式细胞术鉴定其大小功能与数量;通过percol l浓度梯度离心方法获得超纯线粒体,接着透射电子显微镜、流式细胞术等方法观察检测线粒体形态特征以及浓度;应用O2K、线粒体膜电位检测仪鉴定纯化线粒体功能及活性。(3)我们利用低氧培养箱建立神经元损伤模型及脑微血管内皮细胞损伤模型,探讨采用脑源性线粒体共孵育干预后,两种细胞的活力以及氧耗等的变化。(4)通过本实验室先进的脑皮质损伤仪(e CCI)来制备颅脑创伤小鼠模型。将纯化线粒体注射到小鼠创伤灶区域,注射之后我们检测血脑屏障伊文思蓝的渗漏情况;应用免疫组织化学荧光染色和western blot的方法检测CCI小鼠创伤灶内新生血管、细胞凋亡及血管内皮紧密连接相关蛋白等的变化,检测CCI小鼠长时程抑制(long-term depression,LTD)等改变,以及wester n blot技术揭示神经元细胞GAP以及突出蛋白Ⅰ的表达变化情况,探究脑外伤后外源线粒体对小鼠认知功能的影响。结果:采用体外培养细胞的方式获得纯化线粒体的方案,由于得率较低,大批量培养细胞导致实验过于繁琐并且极易出现细胞污染或者细胞状态不佳等,我们采用离体脑组织分离纯化线粒体。并且成功的应用percoll密度梯度离心的方法获取超纯线粒体,成功测得线粒体大小及浓度。通过透射电子显微镜、wester n blot的方法鉴定纯化分离好的线粒体;利用荧光染料metotraker对线粒体进行标记,证实神经元及内皮细胞能够摄入外源功能线粒体;体外实验证实新鲜纯化线粒体既能够促进损伤神经元活力增加以及synaptophysinⅠ及GAP的表达增高又可以增加内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、OCLN表达增。体内实验证实新鲜纯化线粒体既能够降低创伤性颅脑损伤后血脑屏障的伊文氏蓝渗透率以及脑水肿程度;又能够改善创伤灶区海马长时程抑制电生理学现象,从而改善CCI小鼠的认知功能。结论:我们采用新鲜纯化的线粒体改善脑外伤后神经元以及内皮细胞的能量代谢,改善神经元的突触可塑性,提高了脑外伤后的认知功能。中枢神经系统内部细胞之间存在通过转移线粒体可以实现能量传递的机制。由于自身线粒体获得相对容易,而且安全,相信通过进一步的基础和临床研究能够为我们打开一扇通往脑外伤康复的大门。