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疫霉菌(Phytophthora capsici)隶属于卵菌,可以引起多种作物的疫病,对经济造成巨大的损失,包括大豆疫霉、辣椒疫霉、致病疫霉、橡树疫霉等。疫霉菌在进化上与真菌相差甚远,和藻类同属于茸鞭生物界,尽管和其他真菌一样呈丝状生长,但是其致病机理与其他真菌差异显著。基因组测序发现疫霉菌具有编码大量效应分子的基因,其中胞内效应因子包含RxLR和CRN(Crinkler)两大类。RxLR效应蛋白在结构上可分为:信号肽、氨基端RxLR-dEER转运结构域和羧基端功能结构域三部分。研究表明RxLR-dEER类蛋白能够进入植物细胞内,且具有毒性功能。CRN效应分子表达量较高,其高度分化的C末端结构域表明了它们可能具有广泛多样的功能;而N末端包含有一个LxLFLAK保守基序,与RxLR具有类似的功能,能够介导CRN效应分子转运进入植物细胞。尽管目前已经有研究表明效应因子在含有对应抗病蛋白的植物上能够引起植物抗性产生,但是对这些效应蛋白和在感病植株上的作用及其机制还不清楚。酵母文库的筛选:采用酵母双杂交技术,以辣椒疫霉的效应因子RxLR22、CRN4、RxLR242、RxLR207和大豆疫霉的效应因子Avr1b为诱饵蛋白,在拟南芥的cDNA文库中进行寄主靶标的筛选,并对所有的阳性克隆进行提质粒和测序,在NCBI中比对出靶标基因的全长序列与功能信息,分别筛选92个、136个、69个、99个、90个克隆,比对后分别得到78、73、108、62、12个基因,为后续实验提供数据基础。辣椒疫霉效应因子与拟南芥抗病相关蛋白互作筛选与验证:本研究克隆了 72个辣椒疫霉在侵染阶段中表达量较高的效应分子,其中包括CRN家族的34个,RxLR家族的38个,构建到pGBKT7酵母表达载体上,利用酵母双杂交技术,对11个拟南芥抗病信号转导途径中的重要基因(CMPG1、EDS1、BAK1、BIK1、OSD1、RIN4、PAD4、SGT1a、SGT1b、NPR1和NPR3)进行了定向筛选。实验结果表明:RxLR103能与 EDS1、BAK1、BIK1、NPR3 互作,RxLR172 能与 EDS1、SGT1b 互作,RxLR48能与NPR1互作,而RxLR237能自激活,并对所获结果进行了进一步验证。转基因拟南芥的制备:为了研究辣椒疫霉效应因子RxLR103、RxLR172、RxLR237在遗传学及生理生化上的功能,本文将目的基因构建到植物表达载体pART27中,转入到农杆菌GV3101感受态细胞中,通过花序浸泡法进行拟南芥稳定转化,利用卡纳抗性筛选出转基因苗,后期发现RxLR103转基因拟南芥植物表现为矮小现象,而且有一部分枯萎死亡,而RxLR172和RxLR237的转基因植株生长正常。这为以后的实验提供了材料基础。RxLR103初步的功能研究:RxLR103是辣椒疫霉的一个效应分子,利用PVX载体和烟草瞬时表达系统,发现RxLR103能够引起烟草叶片上的细胞死亡,同时亚细胞定位显示,RxLR103在细胞质和细胞核上都有定位。RT-PCR分析表明该基因在辣椒疫霉的侵染后期上调表达,而毒性分析表明RxLR103能够促进辣椒疫霉的侵染。揭示了该基因可能在病原菌从活体寄生到死体寄生的转变过程中起重要作用。