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背景与目的支气管哮喘是儿童时期最常见的慢性疾病之一,其本质为多种炎症细胞介导的慢性气道炎症。“卫生学假说”认为在西方国家由于公共卫生设施的改善、疫苗及抗生素的使用,感染发生率降低,机体Th1功能发育障碍,造成Th1/Th2功能失衡,进而导致了哮喘等变态性疾病发生率大幅度增加。然而,近年来研究表明单纯Th1/Th2功能失衡不能解释哮喘全部的发病机制。我们以往的研究发现,新生期腹腔接种卡介苗(BCG)后,可促进小鼠脾脏中Th1/Tr1发育,且能减轻哮喘气道炎症和气道高反应性(AHR)的发生,但对肺部支气管肺泡灌洗液(BALF)中Th1/Th2细胞因子无明显影响,其机制尚不清楚。近年来,树突状细胞(DC)和调节性T细胞(Tr)在哮喘发病中的作用引起人们广泛关注。作为专职抗原提呈细胞(APC),DC不仅能启动原发免疫应答,诱导Th0细胞向不同的T细胞亚群分化发育,同时可诱导免疫耐受。为了进一步明确新生期BCG接种对T细胞亚群分化发育的作用机制,本研究观察了新生期BCG接种后BALB/c小鼠脾脏和肺DC表型、细胞因子分泌及肺部T细胞改变。方法将新生清洁级BALB/c小鼠分为BCG腹腔接种组、BCG皮下接种组和对照组,同时以清洁级BALB/c成年鼠作为对照。接种4周后:(1)取脾细胞进行流式细胞仪检测DC亚型及成熟度;脾细胞分离后,体外用BCG再刺激培养后ELISA检测上清液细胞因子;(2)取肺细胞进行流式细胞仪检测DC亚型及成熟度,肺细胞分离培养后ELISA检测上清液细胞因子,同时RT-PCR检测肺T细胞特异表达的转录因子mRNA的表达。结果第一部分:新生期BCG接种对BALB/c小鼠脾DC表型和功能的影响:(1)与对照组比较,新生期腹腔接种BCG后,小鼠脾CD8α+DC百分率明显增加,CD8α-DC百分率显著减低,明显上调CD8α-DC的CD40和CD8α+DC的CD86表达,LPS体外诱导的脾脏细胞培养上清液细胞因子IL-12p70和BCG体外诱导的IL-10水平明显升高,IL-6无明显改变。(2)成年期腹腔接种BCG后,小鼠脾CD8α-DC百分率明显高于对照组,CD8α+DC百分率明显低于对照组,CD8α-及CD8α+DC表面的CD40、MHC-Ⅱ类分子表达明显上调,而CD86表达显著下调。(3)成年期BCG腹腔接种后,小鼠脾脏CD8α-DC百分率明显高于新生期BCG腹腔接种组,CD8α+DC百分率显著低于新生期BCG腹腔接种组。DC表面共刺激分子及MHC-Ⅱ类分子表达两组之间无明显差异。(4)新生期腹腔和皮下接种BCG后,小鼠脾DC亚型和表面共刺激分子表达无明显差别。第二部分:新生期BCG接种对BALB/c小鼠肺DC及T细胞的影响:(1)BALB/c小鼠肺DC主要为CD8α-DC,低水平表达MHC-Ⅱ类分子;新生期腹腔接种BCG后,小鼠肺CD8α-DC和CD8α+DC的百分率与对照组无明显差异,显著上调CD8α-DC及CD8α+DC的MHC-Ⅱ类分子表达,肺细胞培养上清液细胞因子IL-12p70及IL-6水平与对照组无明显差别。(2)新生期腹腔接种BCG后,小鼠肺部CD4+CD25+T细胞百分率及Foxp3、T-bet、GATA-3 mRNA表达与对照组比较无统计学意义。(3)成年期腹腔接种BCG后,小鼠肺CD8α-DC百分率显著高于对照组,CD8α+DC百分率明显低于对照组;CD8α-DC的MHC-Ⅱ类分子表达显著高于对照组。(4)新生期和成年期腹腔接种BCG后,小鼠肺DC表型及Foxp3、T-bet、GATA-3 mRNA表达无明显差别。(5)新生期腹腔接种和皮下接种BCG后的小鼠肺DC亚型及Foxp3、T-bet、GATA-3 mRNA表达无明显差别,而新生期腹腔接种BCG组CD8α-DC及CD8α+DC的MHC-Ⅱ类分子表达显著高于新生期皮下接种BCG组。结论1.新生期BCG接种改变BALB/c小鼠脾DC的表型和功能,表现为CD8α+DC百分率增加,CD8α-DC百分率减少,脾细胞接受再次刺激时的细胞因子IL-12p70或IL-10水平明显升高,提示新生期BCG接种可能通过作用于BALB/c小鼠脾DC诱导脾Th1/Tr1反应。2.新生期BCG接种尽管能促进BALB/c小鼠肺部DC成熟,但在转录因子水平再次证实新生期BCG接种对小鼠肺部T细胞亚群分化无明显影响,进一步推测新生期接种BCG对小鼠气道炎症和气道高反应性的抑制作用不是通过作用于肺部T细胞亚群的发育介导的。3.新生期BCG接种对BALB/c小鼠DC的影响作用与成年期接种BCG不同,提示不同时期机体对BCG免疫应答有差异。