前言帕金森氏病（Parkinson’s Disease PD）是目前世界上最常见的慢性神经系统退行性病变之一。其主要症状是运动功能的改变,如运动过缓、静止震颤、步态畸形和姿势不稳等;病变晚期会出现不同程度的非运动功能障碍,包括痴呆、抑郁、精神症状、自主功能缺陷、嗅觉及视觉的损坏。PD的病理学标志是黑质纹状体密质部多巴胺能神经元的选择性丧失及路易小体的出现。目前PD的发病机制还不明确,但是很多研究显示PD是遗传因素和环境因素等多因素导致的,而且已经发现了几种与PD有关的基因,如α-synuclein、Parkin、DJ-1、LRRK2、CUHL1等,其中DJ-1基因的突变可以引起早发型常染色体隐性遗传PD。人DJ-1（PARX7）基因位于1q36,含有8个外显子,开放阅读框编码一个含有189个氨基酸的蛋白质,分子量约为20 kDa。DJ-1蛋白在体外以二聚体的形式存在。用病人的脑组织做免疫组织化学实验,结果显示DJ-1基因主要分布在胶质细胞和含有Tau（微管相关蛋白）的内涵体（inclusion）中,但是内涵体中的DJ-1含量很少。在正常C57BL/6小鼠体内,DJ-1mRNA在神经元细胞和非神经元细胞中都有表达,而且在调节运动功能的组织中表达水平较高。DJ-1基因是氧化还原依赖性的抑制α-synuclein（一种导致PD的蛋白）聚集的分子伴侣,DJ-1^L166P在体内或体外丧失了分子伴侣的功能,不能阻止α-Synuclein聚集,从而导致PD的发生。DJ-1基因对氧化应激的敏感性与其表达水平密切相关,例如过度表达DJ-1基因的多巴胺能神经元细胞通过上调谷胱苷肽的合成增强细胞的抗氧化能力,然而敲除DJ-1基因的鼠和果蝇对各种因子造成的氧化应激的敏感性增高。黑质神经元对Na⁺/K⁺ATPase的损伤非常敏感,DJ-1基因能降低其对能量代谢变化的敏感性,因此DJ-1基因可能阻止能量代谢异常导致的神经元损伤,进而防止PD的发生。PD大鼠模型中,运用注射DJ-1基因进行治疗,能明显抑制6-OHDA诱导的细胞死亡。本实验建立了含有突变型DJ-1^L166P的转基因小鼠模型,并建立了稳定转染pEGFP-C3-DJ-1、pEGFP-C3-DJ-1^L166P质粒的NIH3T3细胞系,在细胞水平研究DJ-1基因及其突变形式DJ-1^L166P与tau基因在表达上的相关性;观察DJ-1基因及DJ-1^L166P对H₂O₂处理的NIH3T3细胞增殖的影响,了解DJ-1基因在细胞凋亡中的作用。方法1、真核表达载体的构建:从人类的神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）提取细胞总RNA,根据GENEBANK中的DJ-1基因序列,设计引物,克隆出DJ-1基因,通过试剂盒定点突变为DJ-1^L166P,分别与真核表达载体pcDNA3.1-myc-his,pEGFP-C3连接,成功构建了重组pcDNA3.1-myc-his-DJ-1^L166P、pEGFP-C3-DJ-1、pEGFP-C3-DJ-1^L166P表达载体。2、DJ-1（L166P）转基因小鼠模型的建立提pcDNA3.1-myc-his-DJ-1^L166P质粒,通过BglⅡ和SalⅠ双酶切,电泳,回收纯化3896bp的片段,注射到C57BL/6小鼠受精卵的雄性原核中,将注射后成活的受精卵移植到ICR假孕母鼠的双侧的输卵管中,待产。取生后20天转基因鼠的鼠尾,提取DNA,进行PCR检测,初步筛选转基因阳性鼠,取阳性鼠的鼠尾DNA,经过HindⅢ酶切,电泳,Southern blot检测,确定转基因阳性鼠。3、稳定转染pEGFP-C3-DJ-1、pEGFP-C3-DJ-1^L166P,pEGFP-C3的小鼠NIH3T3细胞株的建立。培养NIH3T3细胞,按照Lipofectamin plus转染试剂盒的说明书进行转染,500μg/ml的G418进行筛选,10天后,各挑取细胞克隆100个,进行扩增培养。倒置荧光显微镜观察,初步筛选转染阳性的克隆,取阳性细胞,提取总RNA,做RT-PCR,进一步确认阳性细胞克隆。4、DJ-1基因及其突变形式DJ-1^L166P与Tau基因表达的相关性分析。取pEGFP-C3-DJ-1、pEGFP-C3-DJ-1^L166P,pEGFP-C3转染阳性的细胞各一株,进行培养,提取细胞总RNA,反转录为cDNA,设计tau基因的引物,通过RT-PCR检测其在转录水平的表达差异。细胞免疫化学和Western blot检测tau蛋白在三种细胞中的表达差异。5、稳定转染pEGFP-C3-DJ-1、pEGFP-C3-DJ-1^L166P,pEGFP-C3的细胞在H₂O₂的处理下,呈现不同的增值趋势,反应了DJ-1及DJ-1^L166P对细胞凋亡的影响。用200uM H₂O₂分别处理三种细胞,MTT法检测三种细胞的增殖趋势。结果1、转基因小鼠经PCR和Southern blot检测,2号和7号为阳性鼠。2、三种转染细胞各100个克隆,倒置荧光显微镜下观察,pEGFP-C3-DJ-1转染细胞有6个克隆呈绿色,pEGFP-C3-DJ-1^L166P转染细胞2个克隆呈绿色,pEGFP-C3转染细胞9个克隆呈绿色。经RT-PCR检测,绿色细胞均有目的质粒的表达。3、转录及蛋白水平上,DJ-1基因使tau基因的表达下降,而DJ-1^L166P使tau基因表达上升。4、三种转染细胞经过H₂O₂处理后,pEGFP-C3-DJ-1转染细胞增殖受H_2O2影响不明显,pEGFP-C3-DJ-1^L166P转染细胞受H₂O₂影响较大,pEGFP-C3转染细胞增殖受H₂O₂影响居中。结论1、成功建立DJ-1^L166P转基因小鼠模型。2、成功建立稳定转染pEGFP-C3-DJ-1、pEGFP-C3-DJ-1^L166P、pEGFP-C3质粒的小鼠NIH3T3细胞株。3、在转录水平及蛋白水平,DJ-1基因使tau基因的表达下降,而DJ-1^L166P使tau基因表达上升。4、DJ-1基因可以抑制H₂O₂诱导的细胞凋亡,DJ-1^L166P则促进凋亡。