论文部分内容阅读
基因治疗能够从基因组水平治愈人类疾病。非病毒载体相对病毒载体具有较好的生物相容性,但其基因递送和转染效率都较低。本课题组合成的明胶-硅氧烷纳米粒子是一种新颖的有机-无机纳米杂化材料,具有较好的DNA包封和释放性能。但是有关基于明胶-硅氧烷的纳米粒子作为非病毒基因载体的潜能还缺乏深入系统的研究。本文针对基因治疗中的主要屏障,就基于明胶-硅氧烷的纳米粒子作为理想非病毒载体的可行性,开展了一系列的研究,主要包括:(1)通过MTT实验对明胶-硅氧烷纳米粒子(GS NPs)和Tat修饰的明胶-硅氧烷纳米粒子(TG NPs)的细胞生物相容性进行了评价;通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪证实GS NPs和TG NPs均能有效进入Hela细胞;同时,结合胞吞途径特异抑制剂和示踪物确定了GS NPs和TG NPs跨膜进入细胞的机制。(2)通过激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜对明胶-硅氧烷纳米粒子(GSNPs)进入细胞后的转运途径进行了探讨。同时,结合细胞器荧光标记技术,对氯喹、Tat、Kala多肽促进GS NPs逃逸溶酶体的性能进行了研究,结果表明氯喹、Tat、Kala多肽均能促进GS NPs逃逸溶酶体,但氯喹长时间(＞24h)与细胞作用具有明显的细胞毒性,Kala多肽促溶酶体逃逸的性能不稳定;此外,研究发现Tat修饰的GS NPs能够进入细胞核,pALDH Leader多肽修饰的GS NPs能够靶向到线粒体。(3)通过流式细胞仪,结合DNA荧光标记技术,比较了TG NPs和脂质体载运DNA进入细胞的性能,并探讨出DNA浓度、血清对TG NPs载运质粒DNA进入细胞的影响;通过双荧光标记DNA和TG NPs研究出DNA在细胞内环境中的释放和分布情况;通过β-半乳糖甘酶报告基因,系统研究了TG/DNA、Tat/GS、DNA浓度、转染时间和血清对TG NPs介导基因转染的影响,优化并得出最佳转染条件。