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目的:年龄相关性黄斑变性(age-related macular degenerate-on,AMD)是导致55岁以后视力不可逆损害的主要原因之一,其分为干性AMD和湿性AMD。湿性AMD的主要特征是脉络膜新生血管(choroidalneovascularization,CNV),CNV可导致中心视力的突然减退。目前对于CNV的发生机制尚未十分明确,已上市用于CNV治疗的药物主要是针对已形成的CNV,其作用时效短且不能根治CNV。CNV的高发生率、发生机制的不明确性、以及难以根治成为医学的重大挑战。研究表明炎症反应在CNV中起到重要作用,补体旁路途经的激活所产生的膜攻击复合物(menbrane attack comples,MAC)在实验性CNV的发生中起到决定性作用。补体旁路途径中有一关键因子为B因子,前期实验证明通过RNA干扰技术抑制旁路途径中B因子的表达,可以有效地抑制大鼠CNV的发生。基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinase,MMPS)可以降解细胞外基质,有利于CNV穿过Bruch膜,研究发现发生CNV时血管内皮细胞和巨噬细胞分泌MMPs。已有数种MMPs已被证明存在于AMD患者的CNV中。MMP-13与软组织退化性关节炎及多种癌症的发生有关,具有极强的降解细胞外基质能力,其与激光诱导的大鼠CNV是否有关还不得而知。前期实验中已成功构建CFB-siRNA,并通过体外及体内研究证明了CFB-siRNA抑制CNV及其相关生长因子如VEGF、PDGE等的确切性。前期实验中未对CFB-siRNA抑制MAC的沉积做成评价,本实验将进一步完善CFB-siRNA抑制实验性CNV的实验研究,并进一步探讨MMP-13与激光诱导的CNV之间的关系以及MAC的沉积是否能诱导MMP-13的分泌。方法:1CFB-siRNA在体内转染靶向性的实验研究。1.18-10周健康棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠24只,随机分为2组,每组12只。氪激光(波长647nm,光斑直径200μm,功率260mW,曝光时间0.05s)围绕视盘均匀光凝9个点,以见到有气泡产生提示Bruch膜被击穿为准建立大鼠CNV模型。1.2随机分为实验组、实验对照组。实验组与实验对照组均予激光建立动物模型,实验组通过尾静脉注射75μgB因子siRNA,实验对照组通过尾静脉注射生理盐水。注射方式:尾静脉快速注射法;注药时间:光凝后第2天、4天、6天。观察时间为激光后3、5、7、14d。于14d时行荧光素眼底血管造影(FFA)。1.3处死大鼠,摘除眼球取眼后段组织制作石蜡切片。选取激光斑点及其附近处组织做切片,免疫组织化学观察C5b-9(MAC)的表达情况。1.4图像分析与统计学处理。采用SPSS16.0软件对所得数据进行分析,观察CFB-siRNA抑制C5b-9(MAC)表达的情况。2MMP-13表达与CNV形成关系的实验研究。2.18-10周健康棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠30只,分为实验组、空白组。氪激光(波长647nm,光斑直径200μm,功率260mW,曝光时间0.05s)围绕视盘均匀光凝9-10个点,以见到有气泡产生提示Bruch膜被击穿为准建立大鼠CNV模型。2.2实验组予激光建立CNV模型。观察时间为激光后3、5、7、14d。实验组与空白组观察指标为RT-PCR及免疫组织化学观察MMP-13的表达情况。2.3图像分析与统计学处理。采用SPSS16.0软件对所得数据进行统计学分析。3CNV形成过程中MAC的沉积能否诱导MMP-13表达的实验研究。3.18-10周健康棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠24只分为实验组与实验对照组,均予激光建立CNV动物模型。实验组予尾静脉注射75μgB因子siRNA,实验对照组通过尾静脉注射生理盐水。注药时间:光凝后第2天、4天、6天。观察时间为激光后3、5、7、14d。3.2观察指标为RT-PCR及免疫组织化学观察MMP-13的变化(免疫组织化学材料来自实验第一部分与第二部分)。3.3采用SPSS16.0软件对所得数据进行统计学分析。结果:1CFB-siRNA在体内转染靶向性的实验研究。1.1FFA表现为造影早期强荧光斑,晚期出现与视网膜血管无关的荧光素渗漏。1.2实验组比实验对照组CNV发生率明显降低。1.3免疫组织化学结果显示:实验对照组C5b-9(MAC)在第3天时即有沉积,到第5天时达高峰,以后逐渐减低。实验组C5b-9(MAC)一直处于低表达状态。两组各时间点相比较MAC的沉积于光凝后第3、5、7天差异具有统计学意义。2MMP-13表达与CNV形成关系的实验研究。2.1免疫组织化学染色显示MMP-13表达位于细胞浆与细胞核。在实验组中MMP-13于光凝后第5天开始明显增多,7天时达顶峰,以后至14天时表达处于稳定。在空白组中一直处于低表达。两组各时间点相比较于光凝后第5、7、14天表达存在显著差异。2.2RT-PCR结果显示MMP-13在空白组处于低表达,在实验组中MMP-13于光凝后第3天时表达即开始增加,5天时持续增加,7天达顶峰,以后趋于平稳。两组各时间点相比较于光凝后第3天开始差异即有统计学意义。3CNV形成过程中MAC的沉积能否诱导MMP-13表达的实验研究。3.1免疫组织化学及RT-PCR结果均显示实验组与实验对照组MMP-13表达情况基本一致。结论:1尾静脉注射高剂量CFB-SiRNA能够有效抑制激光诱导大鼠CNV的生成,CFB-SiRNA能靶向性抑制实验性CNV中C5b-9(MAC)的表达,同时也证明导致激光诱导的CNV中MAC沉积的途径是补体旁路途径。2MMP-13与激光诱导的大鼠CNV的形成有一定相关性。3抑制MAC的沉积不能抑制MMP-13的分泌,说明在激光诱导的大鼠CNV形成过程中,补体旁路途径与MMP-13处于两条不同的途径。