研究背景：当今,全球糖尿病正处于快速增长期,我国糖尿病患病率也逐年增高,现已成为仅次于印度的糖尿病第二大国。2型糖尿病发病隐匿,患者病程长,随着病程的进展,胰岛β细胞功能渐进衰竭。因此,探索糖尿病的发病机制一直是糖尿病领域研究的热点及重点。糖尿病患者体内的血糖稳态遭到破坏,不仅存在血糖升高,且包含着另一个重要的方面即血糖波动。正常人的血糖受到精密的调控,被限定在一个很小的范围内,而糖尿病患者的血糖波动明显增加。波动性高血糖对糖尿病并发症的影响已有较多的研究,业已证实其能增强蛋白激酶C(PKC)的活性,激活氧化应激反应,同时还可以促进内皮细胞的凋亡。但是关于波动性高糖对胰岛β细胞量及β细胞增殖的影响目前鲜见研究报道。随着研究的深入,人们逐渐认识到胰岛β细胞“质”和“量”的动态变化对于血糖的调控以及糖尿病的临床进程都具有举足轻重的影响。β细胞其数目的变化与其他细胞一样,受到细胞周期进程的调控。β细胞的细胞周期按照各时相(G1-S-G2-M)严格有序进行。细胞周期又受到细胞周期相关系列蛋白的严密调控,其中一些蛋白促进细胞周期进程,起到正性调控的作用,另一方面,一些蛋白阻滞细胞周期进程,对细胞周期进程进行负性调控。很多因素可能通过影响某些细胞周期蛋白,进而使细胞周期的调控障碍而影响细胞增殖,如：高糖、高脂等。细胞周期相关蛋白细胞周期素D1(cyclinD1)是一种促进细胞周期进程的蛋白,它在细胞周期进程中与其相应的细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase CDK)结合在一起,驱动细胞周期进程,cyclinD1在β细胞中表达,调节β细胞的增殖。p21与p27是两个抑制细胞周期进程的蛋白,他们均可与cyclin-CDKs结合,使该复合物的激酶活性丧失,阻滞细胞周期,对细胞周期起到负性调控的作用。S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein-2 Skp2)可通过泛素化降解p27,从而促进细胞周期进程。这几个细胞周期相关蛋白对细胞增殖的影响可能在整个细胞周期进程中起到重要的作用。近年来探寻促进β细胞的增殖及减少凋亡的研究备受关注。胰高糖素样肽-1是由小肠内分泌L细胞分泌的肠道促胰岛激素,可促进胰岛β细胞增殖,减少凋亡,增加胰岛β细胞数量。这使得GLP-1越来越受到研究者们的重视,然而GLP-1是否可以通过改变某些细胞周期相关蛋白而影响β细胞的周期变化,进而影响到细胞的增殖活性,目前仍不明了。因此,本课题以β细胞株INS-1细胞为研究对象,从以下几个方面进行相关研究：1,观察间歇性高糖对INS-1细胞凋亡的影响并探讨其可能的作用机制。2,了解INS-1细胞增殖水平发生变化时的细胞周期分布的改变,通过检测间歇性高糖对细胞周期相关蛋白cyclinD1、p21、p27及Skp2蛋白表达水平的影响,探讨间歇性高糖时INS-1细胞增殖及细胞周期进程与细胞周期相关蛋白变化的关系。3,观察GLP-1受体激动剂Exenatide对间歇性高糖影响INS-1细胞的作用,检测应用Exenatide后细胞增殖、凋亡水平、细胞周期的分布,及细胞周期相关蛋白cyclinD1、p21、p27及Skp2蛋白表达水平,探讨Exenatide对间歇性高糖影响INS-1细胞是否具有保护作用。第一部分间歇性高糖对INS-1细胞凋亡的影响及其机制探讨目的：探讨间歇性高糖对INS-1细胞凋亡的影响及可能的作用机制。方法：(1)INS-1细胞的培养及活性鉴定：以含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基在37℃,5%CO2培养箱中培养细胞。0.4%台盼蓝染色检测细胞活性。(2)间歇性高糖对INS-1细胞凋亡的影响：用6孔板铺板细胞,用无酚红、无血清RPMI-1640预处理,37℃、5%CO2中培养6h,使其处于同步化状态。每24 h换液。实验分为3组：正常葡萄糖浓度组(简称正常糖组),即细胞培养于5.5mmol/L葡萄糖浓度的RPMI-1640完全培养基；恒定性高浓度葡萄糖组(简称恒定性高糖组),细胞培养于30 mmol/L葡萄糖浓度的RPMI-1640完全培养基；间歇性高浓度葡萄糖组(简称间歇性高糖组),即每24 h轮换培养于5.5mmol/L或30mmol/L葡萄糖浓度的RPMI-1640完全培养基。各组细胞在37℃、5%CO2条件下培养7天,Annexin V-FITC/PI流式检测细胞凋亡率。(3)间歇性高糖对INS-1细胞活性氧(ROS)水平及黄嘌呤氧化酶(XOD)水平的影响：分组及培养条件同上,荧光探针DCFH-DA法检测细胞活性氧(ROS)水平,酶标分光光度法检测细胞黄嘌呤氧化酶(XOD)含量。结果：(1)INS-1细胞形态观察及活性测定：INS-1细胞多数为不规则但折光性强,细胞有连接融合倾向,胞浆内可见颗粒。台盼蓝染色细胞活性为(94.00±1.35)%。(2)间歇性高糖对INS-1细胞凋亡影响：在正常糖组,INS-1凋亡较少(8.91±2.92)%,恒定性高糖组INS-1凋亡率增加(20.92±3.88)%,间歇性高糖组INS-1细胞凋亡增多更加明显(30.67±4.48)%。三组间差异有统计学意义(F=40.842,P=0.000),恒定性高糖组和间歇高糖组的凋亡率与正常糖组相比较都具有统计学差异(P=0.000,P=0.000)；间歇性高糖组的凋亡率高于恒定性高糖组(P=0.002)。(3)间歇性高糖对INS-1细胞活性氧(ROS)水平的影响：正常糖组的INS-1细胞内ROS的含量处于较低水平(DCFH平均荧光强度为：156.00±13.27,恒定性高糖组(311.00±22.77)和间歇性高糖组(409.60±12.44)INS-1细胞内ROS的含量均增多,三组间ROS差异有统计学意义(F=288.649,P=0.000),恒定性高糖组和间歇性高糖组ROS水平均高于正常糖组(P=0.000。P=0.000),且恒定性高糖组与间歇性高糖组的ROS水平比较也具有统计学差异(P=0.000)。(4)间歇性高糖对INS-1细胞黄嘌呤氧化酶(XOD)含量的影响：正常糖组INS-1细胞内XOD的含量处于较低水平(XOD的OD值：0.23±0.03),恒定高糖组(0.58±0.03)和间歇性高糖组(0.79±0.03)INS-1细胞内XOD的含量都明显增多,三组间XOD差异有统计学意义(F=847.885,P=0.000),恒定性高糖组和间歇性高糖组与正常糖组之间的差异均具有统计学意义(P=0.000,P=0.000),且恒定性高糖组INS-1细胞XOD含量明显低于间歇性高糖组(P=0.000)。结论：正常糖组INS-1细胞的凋亡率明显低于恒定性高糖组及间歇性高糖组,其中间歇性高糖组的凋亡率最高。其相应的细胞内ROS及XOD含量为：正常糖组<恒定性高糖组<间歇性高糖组,提示氧化应激可能与INS-1细胞凋亡率增高有关。第二部分间歇性高糖对INS-1细胞增殖和细胞周期进程的影响及其分子机制探讨目的：探讨间歇性高糖对INS-1细胞周期调控蛋白水平的影响,进而了解影响INS-1细胞增殖的细胞周期进程的可能分子机制。方法：(1)间歇性高糖对INS-1细胞周期进程的影响：用6孔板铺板细胞,用无酚红、无血清RPMI-1640预处理,即37℃、5%CO2中培养6h,使其处于同步化状态。每24 h换液。实验分为3组：正常糖组,即培养于5.5mmol/L葡萄糖浓度的RPMI-1640完全培养基；恒定性高糖组,培养于30mmol/L葡萄糖浓度的RPMI-1640完全培养基；间歇性高糖组,即每24 h轮换培养于5.5mmol/L或30mmol/L葡萄糖浓度的RPMI-1640完全培养基。各组细胞在37℃、5%CO2条件下培养7天,碘化丙啶染色及流式细胞仪检测细胞周期。(2)间歇性高糖对INS-1细胞cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白表达的影响：分组及培养条件同上,用免疫荧光细胞染色各组INS-1细胞,倒置荧光显微镜下观察INS-1细胞中cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白的表达,用Western-blot检测cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白表达水平,计算蛋白相对灰度值。(3)间歇性高糖对INS-1细胞增殖活性的影响：分组及培养条件同上,CellCounting Kit-8试剂盒检测细胞增殖活性。结果：(1)间歇性高糖对INS-1细胞周期进程的影响：与正常糖组Go/G1期细胞比值(48.75±3.11)%相比较,恒定性高糖组(56.54±3.50)%及间歇性高糖组(65.53±3.63)%的比值明显增高,三组间Go/G1期细胞比值差异有统计学意义(F=30.214,P=0.000)。恒定性高糖组和间歇性高糖组Go/G1期细胞比值均高于正常糖组(P=0.004。P=0.000),间歇性高糖组也高于恒定性高糖组(P=0.001)。(2)间歇性高糖对INS-1细胞cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白表达的影响：Western blot方法检测的三组间cyclinD1蛋白表达水平有显著差异(F值=97.125,P=0.000)。恒定性高糖组(0.31±0.02)及间歇性高糖组cyclinD1表达水平(0.18±0.03)明显低于正常糖组(0.46±0.03),P均=0.000,且间歇性高糖组cyclinD1蛋白表达也低于恒定性高糖组(P=0.001)。Western blot方法检测三组间Skp2蛋白表达水平有显著差异(F=45.972,P=0.000)。恒定性高糖组(0.31±0.03)及间歇性高糖组Skp2表达水平(0.21±0.03)明显低于正常糖组(0.48±0.05),P均=0.000,且间歇性高糖组Skp2蛋白表达也低于恒定性高糖组(P=0.011)。Western blot方法检测三组间p27蛋白表达水平有显著差异(F=79.360,P=0.000)。恒定性高糖组p27表达水平(0.38±0.04)及间歇性高糖组(0.51±0.03)明显高于正常糖组(0.20±0.03),P均=0.000,且间歇性高糖组p27蛋白表达水平也高于恒定性高糖组(P=0.002)。Western blot方法检测三组间p21蛋白表达水平有显著差异(F=50.220,P=0.000)。恒定性高糖组p21表达水平(0.40±0.03)及间歇性高糖组(0.51±0.04)高于正常糖组(0.19±0.05),与正常糖组比较,恒定性高糖组P=0.001,间歇性高糖组P=0.000,且间歇性高糖组p21蛋白表达水平也高手恒定性高糖组(P=0.011)。(3)间歇性高糖对INS-1细胞增殖活性的影响：正常糖组细胞增殖活性较高(OD值：1.51±0.14)。恒定性高糖组(0.67±0.04)与间歇性高糖组(0.45±0.02)的增殖活性都较正常糖组明显降低,三组间差异有统计学意义(F=2778,P=0.000),恒定性高糖组和间歇性高糖组与正常糖组之间的差异均具有统计学意义(P=0.000,P=0.000),且间歇性高糖组明显低于恒定性高糖组(P=0.000)。结论：本部分研究结果显示：体外不同血糖浓度变化影响INS-1细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21,p27,其表达水平为正常糖组<恒定性高糖组<间歇性高糖组；而细胞周期正性调控蛋白cyclinD1,Skp2蛋白的表达水平则是正常糖组>恒定性高糖组>间歇性高糖组,与此相应的是细胞周期进程中G0/G1期细胞比值依次增高,细胞的增殖活性依次减低。这些结果表明：间歇性高糖可通过改变INS-1细胞周期调控蛋白水平,进一步阻滞INS-1细胞周期进程,从而减弱细胞的增殖活性。第三部分艾塞那肽对间歇性高糖影响INS-1细胞增殖及细胞周期进程干预的分子机制目的：通过探讨艾塞那肽对间歇性高糖影响INS-1细胞增殖及细胞周期进程的相关蛋白的作用,了解其干预细胞增殖变化的有关分子机制。方法：(1)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞凋亡的影响：实验分为5组：1,正常糖组,即培养于5.5mmol/L葡萄糖浓度的RPMI-1640完全培养基；2,恒定性高糖组,培养于30 mmol/L葡萄糖浓度的RPMI-1640完全培养基；3,间歇性高糖组,即每24 h轮换培养于5.5mmol/L或30mmol/L葡萄糖浓度的RPMI-1640完全培养基；4,恒定性高糖+Exenatide组,培养基含30mmol/L葡糖糖并加入终浓度为100 nmol/L Exenatide; 5,间歇性高糖+Exenatide组,间歇性高糖的基础上加入终浓度为100nmol/L Exenatide。各组细胞在37℃、5%CO2条件下培养7天,Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡率。(2)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞活性氧(ROS)水平的影响：分组及培养条件同上,荧光探针DCFH-DA法检测细胞活性氧(ROS)水平。(3)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞黄嘌呤氧化酶(XOD)含量的影响：分组及培养条件同上,酶标分光光度法检测细胞黄嘌呤氧化酶(XOD)含量。(4)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞增殖活性的影响：分组及培养条件同上,Cell Counting Kit-8试剂盒检测细胞增殖活性。(5)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞周期进程的影响：分组及培养条件同上,碘化丙啶染色及流式细胞仪检测细胞周期。(6)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白表达的影响：分组及培养条件同上,Western-blot检测cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白的表达,并用免疫荧光细胞化学方法染色各组细胞,观察蛋白表达情况。结果：(1)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞凋亡的影响：各组细胞凋亡结果显示,五组间差异具有统计学意义(F=44.996,P=0.000)。恒定性高糖+Exenatide组的凋亡率(8.81±1.96)%明显低于恒定性高糖组(20.92±3.88)%,P=0.000,而与正常糖组(8.91±2.92)%比较,差异则无统计学意义(P=0.962)。间歇性高糖+Exenatide组的凋亡率为(9.18±2.52)%,明显低于间歇性高糖组(30.67±4.48)%,(P=0.000),与正常糖组(8.91±2.92)%比较,差异无统计学意义(P=0.889)。(2)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞活性氧(ROS)水平的影响：各组细胞内ROS含量：五组间INS-1细胞ROS水平有显著性差异(F=182.781,P=0.000)。恒定性高糖+Exenatide组ROS水平(平均荧光强度为：202.20±14.55)明显低于恒定性高糖组(311.00±22.77),P=0.000,但仍然高于正常糖组(156.00±13.27,P=0.000)。间歇性高糖+Exenatide组ROS水平(196.00±20.32)明显低于间歇性高糖组(409.60±12.44),P=0.000,但仍然高于正常糖组(P=0.001)。(3)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞黄嘌呤氧化酶(XOD)含量的影响：五组间差异具有统计学意义(F=115.038,P,0.000),恒定性高糖+Exenatide组XOD含量(0.26±0.16)明显低于恒定性高糖组(0.58±0.03),P=0.000。但与正常糖组(0.23±0.03)比较差异则无统计学意义(P=0.314)。间歇性高糖+Exenatide组XOD含量(0.23±0.02)明显低于间歇性高糖组(0.79±0.33),P=0.000,而与正常糖组比较,差异无统计学意义(P=0.858)(4)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞增殖活性的影响：五组间差异有统计学意义(F=3026,P=0.000),恒定性高糖+Exenatide组细胞增殖活性(1.54±0.13)明显高于恒定性高糖组(0.67±0.04),P=0.000,且高于正常糖组(1.51±0.14,P=0.018)。间歇性高糖+Exenatide组细胞增殖活性(1.45±0.12)明显高于间歇性高糖组(0.45±0.02),P=0.000,但低于正常糖组(P=0.000)。(5)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞周期进程的影响：研究结果显示：Go/G1期细胞比值五组间差异具有统计学意义,(F=20.054,P=0.000)。恒定性高糖+Exenatide组Go/G1期细胞比值(49.12±3.72)%明显低于恒定性高糖组(56.54±3.50)%,P=0.004,但与正常糖组(48.75±3.11)%比较,没有统计学差异(P=0.872)。间歇性高糖+Exenatide组Go/G1期细胞比值(49.73±4.04)%明显低于间歇性高糖组(65.54+3.63)%,P=0.000,但与正常糖组比较,没有统计学差异(P=0.672)。(6)艾塞那肽对间歇性高糖作用下INS-1细胞cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白表达的影响：五组INS-1细胞cyclinD1蛋白表达差异有统计学意义(F=29.284,P=0.000)。恒定性高糖+Exenatide组cyclinD1表达水平(0.41±0.02)明显高于恒定性高糖组(0.31±0.02),P=0.006。但与正常糖组(0.46±0.03)比较,差异无统计学意义(P=0.131)。间歇性高糖+Exenatide组cyclinD1表达水平(0.43±0.07)明显高于间歇性高糖组(0.18±0.03),P=0.000,但与正常糖组比较,则差异无统计学意义(P=0.347)。五组INS-1细胞Skp2蛋白表达差异有统计学意义(F=65.300,P=0.000),恒定性高糖+Exenatide组Skp2表达水平(0.65±0.05)明显高于恒定性高糖组(0.31±0.03,P=0.000),且高于正常糖组(0.48±0.05,P=0.001)。间歇性高糖+Exenatide组Skp2表达水平(0.66±0.05)明显高于间歇性高糖组(0.21±0.03,P=0.000),且高于正常糖组(0.48±0.05,P=0.001)。五组间p27蛋白表达水平有显著差异(F=54.514,P=0.000)。恒定性高糖+Exenatide组p27表达水平(0.24±0.03)明显低于恒定性高糖组(0.38±0.04),P=0.000。但与正常糖组(0.20+0.03)比较,差异无统计学意义(P=0.114)。间歇性高糖+Exenatide组p27表达水平(0.23±0.02)明显低于间歇性高糖组(0.51±0.03),P=0.000,但与正常糖组比较差异无统计学意义(P=0.092)。五组间p21蛋白表达水平有显著差异(F=40.296,P=0.000)。恒定性高糖+Exenatide组p21表达水平(0.21±0.05)明显低于恒定性高糖组(0.40±0.03),P=0.000。但与正常糖组(0.19±0.05)比较,差异无统计学意义(P=0.540)。间歇性高糖+Exenatide组p21表达水平(0.22±0.03)明显低于间歇性高糖组(0.51±0.04),P=0.000,但与正常糖组比较,差异无统计学意义(P=0.417)。结论：艾塞那肽的干预可减少间歇性及恒定性高糖下INS-1细胞内ROS及XOD水平,进而减少INS-1细胞的凋亡,同时在间歇性或恒定性高糖条件下,艾塞那肽使INS-1细胞周期进程正性调控蛋白cyclinD1及Skp2的表达水平升高,并减少细胞周期抑制性的蛋白p21及p27的表达水平,这一变化可能有利于减轻间歇性及恒定性高糖对INS-1细胞周期的阻滞效应,从而促进了细胞周期进程,增强了INS-1细胞的增殖活性。