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背景脓毒症(Sepsis)是一种由病原感染所引起的全身炎症反应综合征,常合并器官功能障碍,是临床常见的危重症,心肌损伤(Sepsis-induced Myocardial Dysfunction,SIMD)是其最严重的并发症之一。目前临床上关于SIMD的治疗手段有限,随着对脓毒症及SIMD的发病机制的研究深入,目前已有关于其对因治疗的潜在药物或治疗方案,但均尚不成熟。因此,寻找SIMD的靶向治疗方案仍是研究的重点。诸多研究已证实免疫功能紊乱是脓毒症及SIMD发病的核心机制。在脓毒症早期,巨噬细胞识别脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)等致病物质,分泌大量的促炎因子和趋化因子,产生并加剧了机体过度的炎症反应。进而,这种机体过度的炎症反应在一定程度上破坏了细胞的正常代谢,诱导细胞凋亡,加重组织缺血,最终加重组织损伤。然而在SIMD的早期病程中,巨噬细胞发挥着何种作用及具体机制尚不明确,仍待我们进一步探究。白介素37(Interleukin-37,IL-37)是近年来新发现的IL-1家族调节性细胞因子,在多种炎性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤中通过抑制免疫反应发挥保护作用。在细胞外,IL-37与受体IL-18Ra和IL-1R8结合形成复合物,通过抑制NF-κB、MAPK等通路介导抗炎信号,抑制NLRP3、AIM等炎症小体进而减轻组织损伤。然而IL-37对SIMD是否有治疗作用及其具体机制仍需进一步研究。因此,我们提出如下假说:IL-37可以通过调节NF-κB通路抑制巨噬细胞炎症反应,减轻心肌细胞中NLRP3炎症小体的激活,缓解脓毒症所致的心肌炎性损伤,进一步通过体内、体外实验,探索IL-37在SIMD中对心肌损伤的作用及机制。目的1.通过腹腔注射LPS构建脓毒症小鼠模型,腹腔注射IL-37治疗,观察小鼠全身炎症反应的情况,通过小鼠生存率及检测血清炎症因子表达水平评价小鼠的全身炎症反应情况。2.通过小鼠心脏超声、心肌组织病理学检测,评估小鼠心功能及心肌炎性损伤情况,评价IL-37对SIMD的治疗作用。3.通过体外细胞实验,探究IL-37对巨噬细胞炎性反应及心肌细胞中NLRP3炎症小体的作用,阐明IL-37对脓毒症心肌炎性损伤的作用机制。材料与方法1.小鼠一般情况及生存曲线4-6周龄C57BL/6J雄鼠60只,随机分为4组:对照组(Control组)、单纯药物组(IL-37组)、模型组(LPS组)、IL-37治疗组(LPS+IL-37组)。对模型组小鼠予腹腔注射LPS(20mg/kg),对IL-37治疗组小鼠同时予腹腔注射IL-37(1mg/kg)+LPS,对单纯药物组小鼠予腹腔注射IL-37,予对照组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水。喂养至7天,观察、记录小鼠活动度、毛发、饮食等一般情况及小鼠存活情况,构建生存曲线。2.动物实验另取48只小鼠按如上步骤1分组,以24小时为观察研究终点。异氟烷吸入麻醉行心脏超声测量心脏血流动力学参数评估心功能。常规麻醉取材,制备心脏组织病理切片,行HE染色及免疫组织化学染色评估心肌组织损伤及炎症反应、巨噬细胞浸润水平;行ELISA检测评估血清中炎性因子的表达水平;行Western blot评估心肌组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平。3.细胞实验3.1以1μg/ml LPS梯度时间刺激RAW264.7细胞,以梯度浓度IL-37干预RAW264.7细胞,分别收细胞总蛋白,Western blot检测NF-κB磷酸化水平。3.2 RAW264.7细胞分组:对照组、IL-37组、LPS组、LPS+IL-37组。应用LPS及IL-37刺激RAW264.7细胞系,收细胞核蛋白和浆蛋白,Western blot检测NF-κB核易位水平;收细胞总蛋白,Western blot检测NF-κB上游信号通路蛋白表达水平;收细胞总RNA行RT-PCR检测炎症因子mRNA表达水平。3.3收集步骤3.2中RAW264.7细胞上清,与10%DMEM培养基按1:1比例混合,作为条件培养基孵育H9C2细胞;收H9C2细胞总蛋白,Western blot检测NLRP3炎症小体通路相关蛋白的表达水平。结果1.IL-37改善脓毒症小鼠一般情况及生存率对照组及单纯药物组小鼠活动、毛发、饮食等一般情况良好,7天生存率为100%。模型组小鼠活动力弱,毛色暗淡粗糙,饮食量减少,一般情况差,7天生存率为30%;在接受LPS刺激后3-4天内尤显著,后逐渐恢复。IL-37治疗组小鼠一般情况介于以上两者之间,接受LPS刺激后2-3天内尤其明显,后逐渐恢复,7天生存率为60%。2.IL-37降低脓毒症小鼠血清中炎症因子表达水平与对照组血清相比,模型组血清中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平升高;IL-37治疗组血清中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均降低。3.IL-37改善脓毒症小鼠心功能,减轻心肌损伤与对照组小鼠心功能相比,模型组小鼠的LVEF、FS水平降低,LVID(s)增加;IL-37治疗组LVEF、FS水平升高,LVID(s)减少。HE染色示,对照组和单纯药物组心肌组织中,心肌细胞排列规整,无坏死、水肿等病理损伤;模型组心肌组织中,心肌细胞排列紊乱,肌膜破裂伴大量坏死、间质充血、水肿及炎症细胞的浸润;IL-37治疗组心肌组织中损伤情况较模型组小鼠明显减轻。4.IL-37减轻脓毒症小鼠心肌组织炎症反应及巨噬细胞浸润与对照组心肌组织相比,模型组小鼠心肌组织中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平升高,F4/80阳性细胞增多;IL-37治疗组心肌组织中的IL-1β、IL-6和TNF-a表达水平降低,F4/80阳性细胞减少。5.LPS呈时间依赖性促进RAW264.7细胞中NF-κB磷酸化,IL-37呈浓度依赖性地抑制其磷酸化LPS呈时间依赖性地促进RAW264.7细胞系中NF-κB的磷酸化水平提高,在60min时效果最显著;而IL-37呈浓度依赖地降低NF-κB磷酸化水平,浓度为1μg/ml时作用最明显。因此接下来的实验中选择LPS刺激60min,IL-37浓度为1μg/ml。6.IL-37抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB通路的激活和炎症因子的表达与对照组细胞相比,LPS组细胞NF-κB核易位增加,IκBα和IKKα/β磷酸化水平升高;LPS+IL-37组细胞核易位减少,IκBα和IKKα/β磷酸化水平降低。PCR结果显示,与对照组细胞相比,LPS组细胞IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达水平上调;LPS+IL-37组细胞IL-1β、IL-6 mRNA表达水平下调。7.IL-37降低条件培养基孵育的H9C2细胞中NLRP3炎症小体的表达水平LPS组H9C2细胞NLRP3、Caspase1和ASC表达水平与Control组细胞比均升高;LPS-CM组细胞NLRP3、Caspase1和ASC表达水平比LPS组的更高。此外,IL-37+LPS-CM组中NLRP3和ASC表达水平与LPS-CM组中的降低;LPS+IL-37组中ASC表达水平与LPS组中的降低;而LPS+IL-37组中NLRP3表达水平与LPS组中的差异无统计学意义。Caspase1在IL-37+LPS-CM组和LPS-CM组之间及LPS+IL-37组和LPS组之间表达水平差异均无统计学意义。8.IL-37抑制脓毒症小鼠心肌组织中NLRP3炎症小体的表达水平NLRP3免疫组织化学染色示,模型组小鼠心肌组织NLRP3表达水平比对照组提高;而IL-37治疗组NLRP3表达水平下降。进一步Western blot示,模型组心肌组织中NLRP3、Caspase1和ASC表达水平与对照组比均提高;而IL-37治疗组中NLRP3、Caspase1、ASC表达水平均降低。结论1.IL-37能够减轻脓毒症小鼠的全身炎症反应,降低死亡率。2.IL-37能够改善脓毒症小鼠的心功能,减少巨噬细胞浸润,减轻心肌炎性损伤。3.IL-37能够通过抑制NF-κB通路减轻LPS诱导的巨噬细胞炎症反应水平;同时通过抑制NLRP3炎症小体的表达,减轻脓毒症中的心肌炎性损伤。