脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。目前临床治疗脑胶质瘤的标准方案是:手术切除联合放射治疗和3个疗程的替莫唑胺（TMZ）化疗,但脑胶质瘤对TMZ容易产生耐药,导致患者的中位生存时间仅为14.6个月。最新研究发现,脑胶质瘤对TMZ的耐药不仅与脑胶质瘤自身基因表达相关,肿瘤微环境也促进了耐药的产生。我们研究发现程序性死亡受体-1（PD-1）的配体（PD-L1）在耐TMZ（以下简称耐药）脑胶质瘤细胞中高表达。据报道,PD-L1高表达会导致PD-1/PD-L1信号通路持续激活,使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监视和杀伤,并促进肿瘤的生长,加剧肿瘤耐药。当我们采用特定序列的siPD-L1抑制耐药脑胶质瘤细胞PD-L1的表达后,耐药脑胶质瘤细胞中耐药蛋白O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）的表达也明显降低,TMZ对耐药脑胶质瘤的抑制作用明显增强。上述结果提示,通过使用PD-L1特异的siRNA（siPD-L1）沉默耐药脑胶质瘤中PD-L1的表达,不仅能抑制肿瘤微环境中PD-1/PD-L1通路的激活,提高机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,而且还能通过降低MGMT的表达,提高耐药脑胶质瘤对TMZ的敏感性,增强TMZ对耐药脑胶质瘤细胞的毒性,以双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长,提高对耐药脑胶质瘤的治疗效果。然而,siPD-L1在血液循环中不稳定,容易被体内的RNA酶降解,被肾脏迅速清除,加之体内诸多生物屏障（如血脑屏障）对siPD-L1转运的阻碍作用,极大地限制了siPD-L1在脑胶质瘤中的蓄积。如何使siPD-L1在血液循环中稳定,顺利穿过血脑屏障,并高效进入耐药脑胶质瘤细胞浆发挥基因沉默效应,是治疗耐药脑胶质瘤的关键。目的:制备共载siPD-L1和TMZ的核壳形脂质聚合物纳米粒,提高siPD-L1在血液中的稳定性;纳米粒通过葡萄糖转运体介导穿过血脑屏障并高效进入耐药脑胶质瘤细胞,释放siPD-L1和TMZ,沉默耐药脑胶质瘤细胞中PD-L1的表达,增强机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,同时降低MGMT的表达,提高耐药脑胶质瘤对TMZ的敏感性,以双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长。方法:（1）以聚天冬氨酸（PASP）和不同分子量聚乙烯亚胺（PEI,分子量分别为600、1200和1800）为原料,通过二硫键将不同分子量PEI枝接在PASP侧链,合成新型阳离子聚合物PASP-g-PEI₆₀₀、PASP-g-PEI₁₂₀₀和PASP-g-PEI₁₈₀₀,用于压缩siPD-L1;以2-脱氧葡萄糖（Glu）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）为原料,合成2-脱氧葡萄糖修饰的连接物（DSPE-PEG-Glu）,作为脑靶向和脑胶质瘤靶向材料。采用核磁氢谱（¹H NMR）对产物的结构进行鉴定。（2）以DSPE-PEG-Glu、胆固醇及二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）构成的脂质薄膜为壳,以siPD-L1与PASP-g-PEI形成的复合物为核,采用薄膜分散法制备共载siPD-L1及TMZ的核壳形脂质聚合物纳米粒TMZ/siPD-L1@GLPN（PASP-g-PEI）,并以氮磷比（N/P）、粒径、zeta电位、TMZ载药量、环境响应特性及siPD-L1稳定性等为指标对纳米粒进行表征,筛选出压缩siPD-L1效果最佳的PASP-g-PEI连接物。（3）采用细胞毒性实验、溶血实验及小鼠体内实验对空白对照纳米粒scrambled siRNA@PEI_25K、scrambled siRNA@PASP-g-PEI₁₂₀₀、scrambled siRNA@PASP-g-PEI₁₈₀₀和scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)的毒性进行体内外评价（scrambled siRNA为无功能的错配siPD-L1,下同）。（4）设计8条不同序列的siPD-L1,通过western blot法筛选出对脑胶质瘤C₆细胞中PD-L1沉默效果最好的siPD-L1序列。（5）通过western blot法检测TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)对脑胶质瘤C₆细胞及耐TMZ脑胶质瘤C₆细胞（C₆/TR细胞）中目标基因PD-L1的沉默效果;通过细胞毒性实验、克隆形成实验、迁移实验及侵袭实验等考察TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)对C₆细胞及C₆/TR细胞增殖、迁移和侵袭的影响;通过western blot法考察TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)对C₆/TR细胞中MGMT表达的影响。（6）采用激光共聚焦显微镜考察C₆细胞及C₆/TR细胞对siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)的摄取,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)入胞后在C₆/TR细胞内的分布,以及siPD-L1在C₆/TR细胞浆内与PASP-g-PEI₁₈₀₀的解离情况。（7）建立体外血脑屏障模型,通过荧光分光光度计、流式细胞仪和激光共聚焦显微镜考察scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)穿透血脑屏障的效率,血脑屏障模型中bEnd3细胞及C₆/TR细胞对scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)的摄取。建立体外血脑屏障与3D脑胶质瘤细胞球结合模型,考察scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)穿过血脑屏障后对C₆/TR细胞球的穿透力。（8）将荧光素酶标记的C₆细胞、C₆/TR细胞注射入ICR小鼠脑组织,构建原位脑胶质瘤模型,模型建立后第7天,尾静脉注射TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀),每3天给药一次,连续给药4次,通过活体成像仪观察脑胶质瘤的大小;最后一次给药2天后,采用western blot法考察TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)对脑胶质瘤组织内PD-L1及MGMT表达的影响;在模型建立第28天,采用流式细胞仪检测TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)对C₆细胞和C₆/TR细胞原位脑胶质瘤脑组织中效应T细胞、调节性T细胞数量的影响;记录荷瘤小鼠的生存时间。（9）采用活体成像仪观察TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)在荷原位脑胶质瘤小鼠和正常小鼠脑部的分布;采用荧光显微镜观察脑组织切片中脑胶质瘤区域与正常脑组织区域中TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)的分布;采用高效液相色谱（HPLC）检测TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)转运TMZ在小鼠血浆及主要器官组织内的分布。结果:（1）合成了DSPE-PEG-Glu及PASP-g-PEI,结构鉴定表明合成的产物为目标化合物;PASP-g-PEI₁₈₀₀（PEI分子量为1800）能较好地压缩siPD-L1,压缩效果与PEI_25K相当,而且siPD-L1@PASP-g-PEI₁₈₀₀在谷胱甘肽（GSH）存在的条件下能释放出siPD-L1;制备了核壳形脂质聚合物纳米粒TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀),TMZ的载药量为5.23%,粒径为92 nm,zeta电位为-33 mV,形态为球形;siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)能够提高siPD-L1在血清中的稳定性。（2）体内外安全性评价结果显示,相较于scrambled siRNA@PEI_25K,scrambled siRNA@PASP-g-PEI₁₈₀₀的细胞毒性、对红细胞的破坏作用及对小鼠的肝肾毒性明显降低。scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)进一步降低了scrambled siRNA@PASP-g-PEI₁₈₀₀的体内外毒性。（3）cd274-mus-362是对C₆细胞中PD-L1蛋白沉默效果最佳的siPD-L1序列。（4）Western blot结果显示,相比于C₆细胞,C₆/TR细胞PD-L1和MGMT蛋白表达显著提高;TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)能够显著降低C₆细胞及C₆/TR细胞中PD-L1的表达,明显降低C₆/TR细胞内MGMT的表达。体外抗肿瘤实验结果显示,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)能够显著抑制C₆细胞和C₆/TR细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭,其抑制作用明显强于没有2-脱氧葡萄糖修饰的对照纳米粒TMZ/siPD-L1@LPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)以及游离TMZ。（5）激光共聚焦显微镜观察结果显示,与没有2-脱氧葡萄糖修饰的纳米粒siPD-L1@LPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)相比,siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)在C₆细胞及C₆/TR细胞内的蓄积明显增多,根皮苷能够抑制C₆细胞及C₆/TR细胞对siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)的摄取,提示siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)通过葡萄糖转运体介导进入脑胶质瘤细胞内。TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)进入C₆/TR细胞后能大量分布于细胞浆中,仅有少量纳米粒分布在溶酶体内;在C₆/TR细胞浆中,siPD-L1能与PASP-g-PEI₁₈₀₀解离。（6）体外血脑屏障模型研究结果显示scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)穿过血脑屏障的效率显著高于没有2-脱氧葡萄糖修饰的空白对照纳米粒scrambled siRNA@LPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀);scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)在bEnd3细胞及C₆/TR细胞内的蓄积均显著高于scrambled siRNA@LPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀);scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)穿过血脑屏障后能够有效渗透到体外3D耐药脑胶质瘤细胞球的深部区域。提示2-脱氧葡萄糖修饰提高了scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)穿过血脑屏障的效率,scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)对脑胶质瘤组织具有较强的穿透力。（7）成功建立了ICR小鼠原位脑胶质瘤模型。研究结果显示,在C₆细胞原位脑胶质瘤模型中,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)能显著抑制脑胶质瘤的生长,荷瘤小鼠生存时间明显延长,在接种脑胶质瘤细胞后100天,仍有53.3%的小鼠存活,治疗效果明显优于游离TMZ、TMZ/siPD-L1@LPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)及siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)。在C₆/TR细胞原位脑胶质瘤模型中,游离TMZ不能抑制耐药脑胶质瘤的生长,但是TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)却能显著抑制耐药脑胶质瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间;Western blot结果显示,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)能显著降低耐药脑胶质瘤组织内PD-L1及MGMT的表达。流式细胞仪测定结果显示,在C₆细胞和C₆/TR细胞原位脑胶质瘤模型中,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)均能够增加脑组织中效应T细胞的数量,降低调节T细胞的数量。（8）活体成像仪观察结果显示,与TMZ/siPD-L1@LPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)相比,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)在荷瘤小鼠和正常小鼠脑部的蓄积明显增多;荧光显微镜观察结果显示,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)在脑胶质瘤组织内的分布量明显高于正常脑组织;HPLC检测结果显示,相较于TMZ/siPD-L1@LPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀),TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)能够将更多的TMZ转运至小鼠脑组织。结论:TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)能够有效压缩siPD-L1,提高siPD-L1在血清中的稳定性;TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)可被C₆细胞及C₆/TR细胞摄取,释放游离siPD-L1。siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)能够穿过血脑屏障,在脑胶质瘤组织内有效蓄积。TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI₁₈₀₀)沉默耐药脑胶质瘤中PD-L1的表达不仅能抑制肿瘤微环境中PD-1/PD-L1通路的激活,提高机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,而且还能通过降低MGMT的表达提高耐药脑胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,增强TMZ对耐药脑胶质瘤细胞的毒性,双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长,提高对耐药脑胶质瘤的治疗效果。