研究背景:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病病程中最常见的微血管并发症,是西方国家导致终末期肾病的主要原因,近年来随着中国经济发展和人民生活水平提高,DN在我国的发病率呈快速上升趋势,但目前其发病机制尚未完全清楚。目前治疗DN的方法如药物调控血糖和血压、透析治疗、肾脏移植等虽然能够一定程度上改善肾功能,但却难以改善患者长期预后。目前为止尚无治愈糖尿病肾病的有效方法。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stroma cells,BMSCs)由于其易分离提取、具有高度的扩增潜能、不涉及伦理道德问题等优点而被广泛关注。MSCs能够通过修复损伤肾细胞、旁分泌效应、调节免疫状态等有效地控制DN的进展,被认为是减轻肾损伤、促进肾功能恢复的有效方法。然而,经静脉注射的BMSCs存在肾脏靶向归巢效率很低、移植后细胞存活效率欠佳等问题,严重制约了BMSCs对靶器官组织的修复作用。因此,如何提高干细胞肾向性移植有效性是其治疗肾脏疾病的关键。目前对于BMSCs靶向归巢的具体机制仍不明确,但普遍认为BMSCs靶向归巢过程与炎症细胞迁移至炎症损伤部位或淋巴细胞归巢至淋巴结过程相似,靶组织表达的多种粘附因子、趋化因子与其受体间的相互作用均参与BMSCs的靶向归巢。其中,基质细胞衍生因子(Stromal cell-derived factor-1,SDF-1)与其特异性受体CXCR-4结合形成的SDF-1/CXCR-4轴不仅是促进BMSCs靶向归巢最重要的生物轴,而且具有抑制BMSCs凋亡、增加细胞存活率等作用,可多方面提高BMSCs的归巢效率。然而,体外扩增的BMSCs表面CXCR-4受体随传代次数增加而减少,严重限制了其迁移能力。使用病毒载体转染基因的方法可提高干细胞表面受体表达,但此类研究方法因为其可能带来的安全性限制而仅停留在体外实验阶段。此外,使用脉冲式聚焦超声(pulsed focused ultrasound,p FUS)等方法辐照肾组织可以成功提高静脉注射BMSCs靶向归巢效率,但因为其对人体创伤明显、靶向控制率低、缺少临床授权等原因未能得到进一步应用。故发展一种更为安全、有效的增加BMSCs细胞膜表面CXCR-4受体水平和促进其靶向归巢的方法对于提高BMSCs治疗DN效果至关重要。超声靶向击破微泡(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技术作为近年来得到广泛认可的新技术已被应用于多个领域,例如促进基因转染效率、增加药物或基因靶向传递水平、增加血管通透性等。与常用的病毒载体转染技术相比,UTMD可以安全有效的促进非病毒载体的转染效率。另外,课题组前期实验使用UTMD技术可以显著提高BMSCs在大鼠心肌缺血区域和大鼠输尿管梗阻模型肾脏区域的靶向归巢效率。肾脏作为一种高血供、高滤过性器官,对于生物学效应较为敏感,UTMD技术对于DN疾病的干细胞治疗是否同样有效呢?基于以上设想,本研究使用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导建立1型糖尿病肾病大鼠模型,拟使用UTMD技术协同脂质体介导CXCR-4基因修饰体外扩增的BMSCs,同时使用UTMD技术对DN大鼠肾脏区域进行靶向辐照,尝试利用微泡增强的生物学效应改变肾脏微环境,增加靶区粘附因子、归巢因子(特别是SDF-1)的特异性表达,为静脉注射BMSCs靶向归巢创造条件。通过UTMD技术介导CXCR-4修饰BMSCs向DN大鼠肾脏区域靶向归巢与聚集,进而提高干细胞有效靶向归巢效率及减缓DN疾病进程的作用。本研究将基因治疗、干细胞治疗与超声介导的生物学效应相结合,对提高BMSCs移植效率以及治疗DN的有效性、安全性进行研究,并对其可能的机制进行探索,以期为干细胞治疗DN提供新的策略和思路。研究目的:1.探讨UTMD技术联合脂质体实现CXCR-4转染修饰体外扩增BMSCs的有效性、可行性及可能机制,并对转染后BMSCs体外迁移能力进行评估,试图发现一种有效、安全实现CXCR-4基因高效转染的非病毒方法,为提高体外培养BMSCs迁移能力提供新的可能;2.探讨在一定参数条件下诊断超声介导的UTMD促进BMSCs归巢正常大鼠及DN大鼠肾脏的可行性和安全性,以及对肾脏形态结构和功能的影响,并对可能机制进行探索;3.探讨诊断超声介导的UTMD技术促进CXCR-4修饰的BMSCs靶向移植归巢DN大鼠肾脏组织并修复DN的可行性、有效性及可能机制,为探索BMSCs治疗DN新方法提供实验基础。研究方法:1.微泡介导治疗超声协同脂质体促CXCR-4基因修饰大鼠BMSCs的实验研究采用密度梯度离心和贴壁相结合的方法对大鼠BMSCs进行分离培养,选取处于对数生长期的第三代BMSCs用于实验,使用流式细胞技术(Flow cytometry,FCM)检测细胞生长周期和干细胞表面标志物,对BMSCs进行成脂、成骨诱导分化并鉴定。BLAST软件对大鼠CXCR-4基因比对后得到基因序列并构建p Ds Red-CXCR-4质粒,使用UTMD技术协同脂质体对BMSCs进行基因转染,并用激光共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope,LSCM)、逆转录PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western-blot,WB)、免疫荧光、FCM等技术检测CXCR-4受体表达情况,Transwell实验评估转染后BMSCs体外迁移能力的变化,扫描电镜观察UTMD协同脂质体作用对于BMSCs造成的损伤并对基因转染效率增加的原因进行初步分析。2.诊断超声介导的微泡破坏技术促BMSCs归巢健康大鼠肾脏并评估其安全性使用携带红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)的慢病毒对BMSCs进行转染,以RFP作为干细胞在体内的示踪剂。将实验大鼠随机分为四组:对照组(Con组)、单纯微泡组(MB组)、单纯超声辐照组(US组)和超声联合微泡辐照组(UTMD组)。对各实验组大鼠肾脏分别处理后经尾静脉注射RFP-BMSCs,并在处理后12h、24h、48h和72h取出大鼠肾脏制作冰冻切片,使用LSCM观察肾脏内红色荧光分布并定量分析,实时荧光定量PCR(Real time q PCR)检测肾组织中RFP m RNA的表达以定量评估干细胞在肾脏靶向归巢情况。检测大鼠血清肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)评价肾功能的变化;HE、PAS染色法观察UTMD处理后肾组织病理水平变化进而评估此方法的安全性。WB和酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测处理后肾脏组织各种归巢促进因子和炎症因子的变化情况,透射电镜观察肾脏微血管内皮细胞超微结构的相关改变,对促进BMSCs靶向归巢的机制做初步探索。3.诊断超声介导的微泡破坏技术促BMSCs靶向归巢DN大鼠肾脏的实验研究SD大鼠腹腔注射STZ建立1型DN模型,检测大鼠随机血糖浓度和24小时尿微量白蛋白含量评价模型是否成功建立。为了尽可能减少实验中可能存在的误差,本研究使用诊断超声介导的微泡破坏技术对DN大鼠右侧肾脏进行靶向辐照,左侧肾脏设为内部对照。经尾静脉注射RFP-BMSCs后24h、48h和72h将DN大鼠两侧肾脏取出制作冰冻切片,使用LSCM观察肾脏内红色荧光分布,Real-time q PCR检测肾组织中RFP m RNA的含量评估BMSCs靶向归巢情况。检测肾功能、HE和PAS染色等方法评估UTMD技术对DN大鼠肾脏可能造成的损害。使用免疫组化、WB和ELISA法检测肾脏组织各种归巢促进因子和炎症因子的变化情况,透射电镜观察肾脏微血管内皮细胞超微结构的相关改变,对BMSCs靶向归巢DN大鼠肾组织效率增加的机制做初步探索。4.诊断超声介导的微泡破坏技术促经静脉移植CXCR-4修饰BMSCs归巢并改善大鼠DN的实验研究将构建成功的DN大鼠模型随机分为对照组(Con)、超声辐照靶向击破微泡组(UTMD)、单纯BMSCs注射组(BMSCs)、CXCR-4转染BMSCs组(CXCR-4+BMSCs)、UTMD处理后注射BMSCs注射组(UTMD+BMSCs)、UTMD处理后注射CXCR-4转染BMSCs注射组(UTMD+CXCR-4+BMSCs),经尾静脉注射RFP-BMSCs后24h、48h和72h将DN大鼠两侧肾脏取出制作冰冻切片,使用LSCM观察肾脏内红色荧光分布,Real-time q PCR检测肾组织中RFP m RNA的含量以评估BMSCs靶向肾组织归巢情况。各实验组DN大鼠进行相应处理3d、7d、14d后分别检测治疗效果,对各实验组DN大鼠血糖浓度、24h尿蛋白及尿UAER值变化进行检测;PAS染色对各实验组DN大鼠肾脏损伤进行观察;使用Real time-q PCR、WB方法分别检测肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、转化生长因子β1(Transforming growth factorβ,TGF-β1)在不同时相点的肾脏表达水平。结果:1.微泡介导治疗超声协同脂质体促CXCR-4基因修饰大鼠BMSCs的实验研究成功分离培养大鼠BMSCs,FCM结果显示细胞表面高表达CD29,CD44和CD90,几乎不表达CD34,CD45和CD11b,BMSCs成脂、成骨诱导培养成功。使用UTMD技术协同脂质体对第三代BMSCs进行p Ds Red-CXCR-4基因转染,48h后使用LSCM和FCM定性和定量检测结果显示UTMD技术协同脂质体可以显著增加干细胞中RFP的表达,RT-PCR结果显示CXCR-4基因转染效率在UTMD技术协同脂质体处理组BMSCs显著高于其余实验组。WB、FCM和免疫荧光技术检测BMSCs细胞膜表面CXCR-4受体蛋白表达水平与以上结果一致。Transwell迁移实验结果显示UTMD技术协同脂质体处理后BMSCs迁移能力显著高于其余实验组。转染后BMSCs形态仍为梭形,生长良好,成脂、成骨分化功能正常。扫描电镜可见处理后BMSCs细胞膜表面出现可复性大小不一的小孔和裂隙。2.诊断超声介导的微泡破坏技术促BMSCs归巢健康大鼠肾脏并评估其安全性携RFP慢病毒对培养3代BMSCs进行转染后可见绝大部分BMSCs呈现明亮的红色荧光,RFP转染阳性率约97%,可作为BMSCs示踪标记。各实验组健康大鼠经相应处理后12h、24h、48h和72h,LSCM观察结果显示UTMD组大鼠肾脏RFP-BMSCs细胞数目显著高于其余各实验组,差异有统计学意义;Real-time q PCR检测结果与其结论一致。病理检查结果显示UTMD处理后肾小球未见明显损伤,肾间质可见少量炎细胞浸润,未出现出血、坏死、组织结构紊乱等现象。肾功能检查Scr和BUN结果显示经相应处理后肾功能无明显改变。WB和ELISA结果显示UTMD处理后肾脏组织表达归巢促进因子(E-selectin、VCAM-1、SDF-1、VEGF)及炎症趋化因子(IL-1α,IL-2,IL-3,IFN-γ,TNF-α,MCP-1和MIP-α)与其余各实验组相比显著增加,并在处理后72h恢复至正常水平。透射电镜观察到UTMD作用后肾脏间质毛细血管内皮细胞变的不连续、不光滑,内皮细胞完整性破坏。3.诊断超声介导的微泡破坏技术促BMSCs靶向归巢DN大鼠肾脏的实验研究大鼠腹腔注射STZ一周后可出现精神不振、多饮、多食、多尿、活动减少等体征,随机血糖浓度大于16.7mmol/L,4周后检测到尿微量白蛋白,提示早期DN模型成功建立。LSCM观察发现静脉注射的RFP-BMSCs主要归巢于DN大鼠处理侧(右侧)肾间质毛细血管周围,而在对照侧(左侧)肾脏组织仅能观察到很少红色荧光表达。UTMD处理24h、48h和72h后右侧肾脏归巢的BMSCs数目显著高于左侧肾脏归巢数目,差异有显著统计学意义(P<0.05);Real-time q PCR检测结果与其结论一致。HE染色检查结果显示DN大鼠肾脏经UTMD处理24h、48h后可见轻微出血和炎症反应,72h后基本恢复正常;PAS染色检查结果显示UTMD处理后肾脏未出现出血、坏死、组织结构紊乱等现象;肾功能检查结果显示BUN和Scr值无明显改变。WB和ELISA结果显示UTMD靶向辐照DN大鼠肾脏24h和48h后肾脏组织表达归巢促进因子(E-selectin、VCAM-1、SDF-1、VEGF)及炎症趋化因子(IL-1α,IL-2,IL-3,IFN-γ,TNF-α,MCP-1 and MIP-α)比对照侧肾脏显著增加,并在处理后72h恢复至正常水平。透射电镜观察到UTMD作用后DN大鼠肾脏间质毛细血管内皮细胞变的不连续、不光滑,内皮细胞完整性破坏。4.诊断超声介导的微泡破坏技术促静脉移植BMSCs归巢并修复DN的实验研究LSCM观察显示静脉注射的RFP-BMSCs主要分布于DN大鼠肾间质毛细血管周围,各实验组进行相应处理24h、48h和72h后发现UTMD+CXCR-4+BMSCs组大鼠肾脏RFP-BMSCs数目显著高于其余各实验组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。DN大鼠经BMSCs治疗后血糖浓度显著下降,与肾脏归巢干细胞数目无显著相关。BMSCs组、CXCR-4+BMSCs组、UTMD+BMSCs组及UTMD+CXCR-4+BMSCs组DN大鼠经移植BMSCs治疗7d后24h尿蛋白及尿UAER值与Con组相比均逐渐下降,差异有显著统计学意义(P<0.05),各组之间差异均有统计学意义(P<0.05),其中UTMD+CXCR-4+BMSCs组24h尿蛋白及尿UAER值显著低于其余各实验组,差异有显著统计学意义(P<0.05),但均未恢复至正常水平。肾脏PAS染色结果显示未移植BMSCs的DN肾脏表现为肾小球硬化、基底膜增厚、系膜区基质增生、糖原在肾组织堆积,未经BMSCs治疗DN肾脏损伤程度稍轻。Real-time q PCR、WB方法分别检测TNF-α和TGF-β在不同时相点DN大鼠肾脏的表达水平,结果显示在UTMD组和Con组DN大鼠肾脏有较强表达,在BMSCs组、CXCR-4+BMSCs组、UTMD+BMSCs组和UTMD+CXCR-4+BMSCs组均逐渐减弱,表达较Con组减少且差异显著(P<0.05),其中UTMD+CXCR-4+BMSCs组DN大鼠肾脏TNF-α和TGF-β的表达在各个时相点均低于同时期其余各组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.成功使用对大鼠BMSCs进行分离、培养、鉴定及纯化,提示体外传代培养的BMSCs呈低分化状态,具有较强的增殖和分化能力。2.UTMD技术协同脂质体可以通过“声孔效应”安全有效增强p Ds Red-CXCR-4基因在第三代BMSCs转染效率和表达水平,显著增强BMSCs的体外迁移能力。3.使用携RFP慢病毒对培养的第3代BMSCs进行转染可使BMSCs长时间呈现明亮且表达稳定的红色荧光,可以有效标记干细胞进而示踪其在靶器官的分布。4.使用诊断超声介导的微泡破坏技术辐照健康大鼠肾脏可以安全、有效的增加BMSCs靶向归巢的效率,初步探讨其机制发现“空化效应”对肾脏间质毛细血管的可逆性损伤导致肾脏局部微环境改变可能是造成BMSCs归巢效率增加的主要原因。5.腹腔注射STZ可以建立稳定的大鼠1型糖尿病肾病模型,通过检测随机血糖浓度、24h尿微量白蛋白等指标可以证实DN模型建立成功。6.诊断超声介导的微泡破坏技术辐照DN大鼠右侧肾脏可以安全、有效的增加BMSCs靶向归巢右侧肾脏的效率(左侧肾脏作为内部对照),初步探讨其机制发现超声介导的微泡破坏技术所产生的“空化效应”可对辐照侧肾脏间质毛细血管造成可逆性损伤,其产生的局部炎症反应导致肾脏局部微环境改变可能是造成BMSCs靶向归巢效率增加的主要原因。7.使用诊断超声介导的微泡破坏技术能够增加CXCR-4修饰BMSCs靶向归巢DN大鼠肾脏的效率,通过抑制促纤维化因子TGF-β1和炎症因子TNF-α的表达从而促进糖尿病肾病大鼠肾功能的改善。