论文部分内容阅读
目的本课题共收集了6个中国汉族PKD家系,将其与国内外已报道的PKD家系进行对比研究,深入挖掘中国汉族PKD家系自身特殊的临床特点,并选择具有代表性的家系进行基因定位与克隆研究,定位中国汉族PKD新的致病基因位点,期待克隆出PKD的致病基因。方法1)临床研究:综合已收集的6个PKD家系和中国已报道的12个PKD家系,与国外的42个PKD家系进行临床分析以及发病年龄、严重程度的配对t检验和wilcoxon符号秩和统计学分析。2)基因定位:选择家系结构好、患病人数多的家系A进行基因定位研究。首先选择24个微卫星位点对涵盖EKD1和EKD2的整条16号染色体进行排除定位;在排除了家系与16号染色体的连锁关系后,利用商业化的ABI全基因组连锁试剂盒Linkage Mapping Setv.2.5-MD10进行STR全基因组扫描,并在全扫的阳性区域内进一步增加微卫星位点进行精细定位;为了进一步验证STR扫描的结果,同时更加深入的挖掘该家系所包含的遗传信息,利用全基因组Linkage-12 SNP芯片对家系进行的再次扫描和定位,并采用Genehunter-2-locus软件对阳性区域进行2个致病位点相互作用检验。3)候选基因克隆:采用功能-候选克隆的策略,筛选4个已知基因(KCNG3、SLC8A1、PRKCE和FGF12基因)作为候选基因进行测序和突变分析。结果1)临床表型上,中国单纯型PKD家系存在发病年龄逐代提前和(或)严重程度加重的遗传早现现象:统计学上,中国单纯型PKD家系代与代之间的平均年龄差为5.2岁,有显著的统计学差异(配对t检验和Wilcoxon符号秩检验P值均＜0.0001),而复杂型PKD发病年龄并无显著差异(P＞0.01)。2)参数和非参数分析排除了该家系的致病基因与16号染色体存在连锁关系。STR全基因组扫描在D3S1580处获得了最大的两点LOD值1.75(θ=0),其最大多点LOD值和NPL值分别为1.60和4.64(P=0.004),将这个PKD家系的致病基因位点初步定位于D3S1262和D3S1311之间的区域。进一步的精确定位在D3S3669处得到最大的LOD值2.82(θ=0),NPL值9.83(P＜0.0001);单体型分析将致病基因定位于D3S1314和D3S1265之间约10.2 cM大小的区域,对应NCBI的Marshfield图谱,相当于3q28-29的区域。全基因组SNP芯片扫描结果发现除3q28-29外,还存在另一个连锁信号较强的区域2p21-22,其位置分别位于2号染色体rs1509562至rs1016607之间约7.18cM(LOD值为2.35;NPL值为5.30;P＜0.00001)和3号染色体rs10937369至rs711995之间约13.78cM(LOD值为2.39;NPL值为5.74;P＜0.00001)的区域。两位点相互作用检验结果在基于倍增模型的前提下得到最大的two-locus LOD值3.81,同时最大two-locus NPL值也升至7.81(P=0.0006),提示PKD可能同时存在两个致病基因位点2p21-22和3q28-29。3)在对4个候选基因中的测序分析中发现了8个DNA序列变异,其中有两个DNA序列的改变导致所编码的氨基酸发生变化,但未见与该PKD家系的表型发生共分离,说明这8个DNA序列变异均为单核苷酸多态,从而排除了这4个候选基因为该PKD家系致病基因的可能。结论1)发作性运动诱发性运动障碍可分为单纯型和复杂型两种亚型。中国单纯型发作性运动诱发性运动障碍家系可能存在遗传早现现象。2)通过STR和SNP全基因组扫描,获得了中国汉族单纯型PKD家系2个新的致病基因位点,分别位于2p21-22和3q28-29,且这两个位点可能存在一定的相互作用。3)基本排除KCNG3、SLC8A1、PRKCE和FGF12基因为新的PKD致病基因的可能。