【摘 要】
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目的:利用耻垢分枝杆菌（MS）过表达结核分枝杆菌PknG,了解PknG促进分枝杆菌在巨噬细胞内存活的作用及其机制。方法:通过PCR扩增结核分枝杆菌PknG全基因,构建p MV261-PknG质粒及原核表达质粒p ET28a-PknG,将p MV261-PknG质粒电转至MS感受态构建过表达结核分枝杆菌PknG的耻垢分枝杆菌（MS::PknG）,PCR及Western blot技术验证MS::Pkn
【基金项目】
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遵义市科学技术局科学技术基金项目,遵市科合HZ字（2019）70号； 贵州省科技计划项目（合同编号:黔科合支撑[2019]2804号）； 国家自然科学基金（项目批准号:81760003）；
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目的:利用耻垢分枝杆菌（MS）过表达结核分枝杆菌PknG,了解PknG促进分枝杆菌在巨噬细胞内存活的作用及其机制。方法:通过PCR扩增结核分枝杆菌PknG全基因,构建p MV261-PknG质粒及原核表达质粒p ET28a-PknG,将p MV261-PknG质粒电转至MS感受态构建过表达结核分枝杆菌PknG的耻垢分枝杆菌（MS::PknG）,PCR及Western blot技术验证MS::PknG耻垢分枝杆菌菌株构建成功,液体培养法测定体外生长曲线,同时用MS::PknG及MS::Vector以MOI=20感染RAW264.7,通过计数菌落形成单位检测重组菌株的胞内存活能力。用耻垢分枝杆菌菌株（MS::PknG）及空载菌株（MS::Vector）以MOI=10感染RAW264.7,通过q PCR检测其相关细胞因子的表达。同时,将质粒p ET28a-PknG转化至大肠杆菌BL21感受态中,通过IPTG诱导表达及镍柱纯化结核分枝杆菌PknG蛋白,考马斯亮蓝染色及Western blot验证PknG蛋白的表达,将PknG蛋白作用于脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞RAW264.7,运用q PCR检测原核表达结核分枝杆菌PknG蛋白对于炎症细胞因子的影响。了解PknG是否通过调节炎症细胞因子的表达从而促进分枝杆菌在巨噬细胞内的存活。结果:成功构建pMV261-PknG、pET28a-PknG质粒,PCR及Western blot验证过表达结核分枝杆菌PknG的耻垢分枝杆菌菌株（MS::PknG）构建成功,MS::PknG与MS::Vector的体外生长速率无明显差异。重组菌株感染巨噬细胞后,菌落形成单位计数结果提示PknG能够增强重组菌株在巨噬细胞内的存活能力,通过从m RNA水平测定分枝杆菌感染巨噬细胞的炎性细胞因子结果显示,MS::PknG明显降低了感染巨噬细胞中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12、IL-1β的表达水平。通过将原核表达质粒p ET28a-PknG转化至BL21感受态中,经IPTG诱导表达及镍柱纯化,成功获得PknG蛋白,q PCR结果提示PknG蛋白能够抑制LPS诱导的细胞因子IL-6和TNF-α的表达,并且随着PknG浓度增加,抑制作用更加显著。结论:耻垢分枝杆菌过表达PknG后其体外生长速率不受影响,但在感染巨噬细胞后,其胞内存活能力显著增强,说明结核分枝杆菌PknG能够促进分枝杆菌在巨噬细胞内的存活。耻垢分枝杆菌过表达及原核表达PknG后抑制感染巨噬细胞细胞因子IL-6和TNF-α的释放,由此推测PknG可能通过抑制炎性细胞因子的表达,逃逸宿主免疫攻击,从而促进结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活。本研究进一步探讨了结核病的致病机制并为靶向治疗提供了一定的依据。
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