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结外NK/T细胞淋巴瘤（extranodal NK/T-cell lymphoma, ENKTL）是一类高度侵袭性非霍奇金淋巴瘤。目前尚没有标准治疗方法，化疗是晚期ENKTL的主要治疗方法，常规CHOP方案（阿霉素，环磷酰胺，长春新碱，强的松）效果差。已有研究证实吉西他滨为基础的化疗方案优于传统的蒽环类为基础的CHOP化疗方案，明显改善结外NK/T细胞淋巴瘤的临床预后。但是，仍有一部分患者出现疾病进展或短期复发，耐药的发生是导致治疗失败的主要原因。在这个研究中，我们应用蛋白质组学和生物信息学方法对吉西他滨为基础化疗方案敏感性不同的结外NK/T细胞淋巴瘤进行差异蛋白质组学分析，进一步筛选验证差异表达蛋白与预后相关性，并研究其在NK/T细胞淋巴瘤YTS细胞中的作用及吉西他滨耐药机制。 第一章：疗效相关晚期NK/T细胞淋巴瘤差异表达蛋白筛选 目的： 通过蛋白质组学分离鉴定吉西他滨为基础化疗方案化疗耐药和敏感的NK/T细胞淋巴瘤的差异表达蛋白，确定在化疗耐药中关键分子及预测生物标志物提供依据。 材料与方法： 1.收集NK/T细胞淋巴瘤患者治疗前血清，根据治疗反应分为有效组和无效组，采用差异蛋白质组学方法进行两组间差异表达蛋白鉴定，获得NK/T细胞淋巴瘤相关差异表达蛋白谱，并对鉴定的差异表达蛋白进行生物信息学分析。 2.进一步应用ELISA验证了14-3-3ζ的表达情况，应用Kaplan-Meier进行生存分析观察14-3-3ζ的表达水平与NK/T细胞淋巴瘤的预后相关性，应用Cox比例风险回归模型确定OS和PFS的预后因子。 结果： 1.蛋白质组学方法获得吉西他滨为基础方案有效组和无效组血清的差异表达谱，无效组中有61种蛋白表达上调，22种表达下调，其中14-3-3ζ蛋白在无效组表达上调。 2. ELISA验证结果发现，14-3-3ζ在无效组表达水平高于有效组（p=0.0047），14-3-3ζ的浓度分界值0.095ng/ml（敏感性64.0％，特异性85.7%，曲线下面积0.707）。 3.高14-3-3ζ组和低14-3-3ζ组的2年OS分别是17.1%和51.9%(p=0.0003)。高14-3-3ζ组和低14-3-3ζ组的2年PFS分别是15.8%和58.6%(p=0.0001)。单因素生存分析中发现，治疗前14-3-3ζ水平升高不良预后明显相关（(p<0.0001） 结论： 1.我们首次分析鉴定了吉西他滨为基础方案化疗敏感性不同的晚期NK/T细胞淋巴瘤的差异表达蛋白。 2.晚期结外NK/T细胞淋巴瘤患者14-3-3ζ水平升高预示不好的OS和PFS。高水平14-3-3ζ(≥6.095ng/ml)是晚期结外NK/T细胞淋巴瘤的不良预后因素。 第二章：14-3-3ζ在NK/T细胞淋巴瘤YTS细胞的作用 目的： 探索14-3-3ζ对NK/T细胞淋巴瘤YTS细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和侵袭迁移能力的影响。 材料与方法： 1.构建针对14-3-3ζ的干扰RNA，转染并筛选出稳定转染YTS细胞，下调14-3-3ζ表达。 2.应用CCK-8法检测各组细胞的增殖能力，流式细胞术检测周期和细胞凋亡率，Transwell小室实验检测各组细胞的侵袭迁移能力。 结果： 1.成功构建针对14-3-3ζRNAi慢病毒载体及成功转染YTS细胞。 2.转染YTS细胞后，与未转染组、空载体转染组相比，RNAi-14-3-3ζ组细胞增殖能力显著降低（p＜0.05）。 3.流式细胞术结果显示，与对照组相比，RNAi-14-3-3ζ组细胞 G2/M期细胞比例升高（p＜0.05），凋亡率升高（p＜0.001）。 4. Transwell小室实验结果显示，与对照组相比，RNAi-14-3-3ζ组细胞增殖能力降低（p＜0.01）。 结论： 1.14-3-3ζ可以促进YTS细胞增殖和增加侵袭能力。 2.14-3-3ζ能够增加G2/M期细胞比例，调控细胞周期。 3.14-3-3ζ能够抑制YTS细胞凋亡。 第三章：14-3-3ζ调控NK/T细胞淋巴瘤YTS细胞吉西他滨耐药的分子机制 目的： 探索14-3-3ζ在NK/T细胞淋巴瘤YTS细胞吉西他滨耐药的机制。 材料与方法： 1.采用吉西他滨低浓度持续诱导，建立吉西他滨耐药的YTS细胞。 2.应用Western blotting方法检测YTS细胞和耐吉西他滨YTS细胞的14-3-3ζ表达水平。 3.应用CCK-8法检测各组细胞的增殖能力，流式细胞术检测周期和细胞凋亡率，Transwell小室实验检测各组细胞的侵袭迁移能力。 4.应用Western blotting方法检测在各组细胞中的Bcl-2、Bax、Caspase-3、p53、P-gp和Cyclin D1的表达水平。 结果： 1.成功建立吉西他滨耐药的NK/T细胞淋巴瘤细胞系（YTS-Gem）。 2.对比野生型YTS细胞组，吉西他滨耐药YTS细胞组14-3-3ζ表达水平上调。 3.14-3-3ζ能够促进YTS-Gem细胞生长侵袭，增加G2/M期细胞比例，调控细胞周期，以及抑制细胞凋亡。 4. Western blotting结果显示，下调14-3-3ζ后，吉西他滨耐药组YTS细胞P-gp表达降低（p＜0.05），Cyclin-D1表达降低（p＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2、Caspase-3、p53表达水平下降（p＜0.05），促凋亡蛋白Bax表达水平升高（p＜0.05）。 结论： 14-3-3ζ通过表达P-gp和抑制凋亡诱导NK/T细胞淋巴瘤YTS细胞对吉西他滨耐药。