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肠道病毒EVD68是小RNA病毒科,肠道病毒属D种的病毒,近年来肠道病毒的在全球范围内爆发感染,引起了广泛的关注。全球各个国家纷纷将EVD68病毒作为公共卫生系统的重点监测对象。目前针对EVD68病毒感染尚没有有效的预防性疫苗和治疗性药物上市。本研究工作的第一部分内容,介绍了一种基于灭活全病毒颗粒的EVD68疫苗。首先我们在500ml的搅拌瓶中,使用cytodex-1微载体密度为5g/L的培养条件下,实现了微载体辅助的Vero细胞悬浮培养,随后经过病毒感染条件的优化,确定了以MOI=1/5000的病毒感染,并在病毒感染之后第5天收获病毒上清液的最佳病毒培养条件。收获的病毒滴达108.15TCID50/ml。随后病毒液经过β丙内酯(β-propiolactone,BPL)灭活与PEG沉淀浓缩和蔗糖梯度超速离心纯化等步骤,获得了高纯度的灭活病毒颗粒。经过病毒衣壳蛋白生化分析和病毒形态的电镜分析,明确了病毒的衣壳蛋白的组成以及病毒30nm球形颗粒形态。最后用EVD68灭活病毒疫苗免疫小鼠之后,在小鼠体内诱导产生了针对EVD68病毒的特异性抗体反应,抗灭活病毒的血清在体外对EVD68的原型株(Fermon)和流行株病毒均表现出很强的中和作用。此部分研究,开发了基于灭活病毒的EVD68的候选疫苗,为对抗EVD68病毒感染提供了可能的选择。第二部分制备了基于病毒样颗粒(Virus Like Particles,VLP)的EVD68疫苗。考虑到灭活疫苗产量低,存在安全性隐患等可能存在的问题,因此我们尝试利用重组杆状病毒,在昆虫细胞中共表达流行株EVD68病毒的P1前体蛋白和3CD蛋白酶,开发一种基于VLP的EVD68疫苗。生化和电镜分析表明,EVD68 VLPs由来自P1前体的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白组成,其外观和大小是类似于天然病毒的球形颗粒。用EVD68 VLPs免疫小鼠可产生抗体,这些抗体在体外能够特异性识别VLP和灭活病毒颗粒,并且对EVD68的原型株和流行株表现出广谱的中和活性。随后使用实验室建立的EVD68小鼠评价模型,进行的母传保护和血清被动保护试验,都证实了VLP疫苗能够对EVD68病毒的感染提供完全的保护效果。基于上述对EVD68疫苗的研究,验证了中和性抗体在宿主对抗病毒的感染中发挥着重要作用。因此在第三部分的研究,使用之前制备的灭活疫苗和VLP疫苗免疫小鼠,利用杂交瘤技术,制备出了9个针对EVD68病毒不同毒株的中和性抗体。随后通过筛选单克隆抗体逃逸株病毒,获得了一系列衣壳蛋白发生突变的病毒株,通过分析这些病毒突变株对所有中和抗体的中和谱,我们将针对Fermon病毒和US/MO/14-18947病毒的中和抗体,按照中和谱相同或相似性,分别归类为3个抗体组。将每个抗体组中的单抗逃逸株病毒衣壳蛋白测序之后,我们得到一系列的突变位点信息。把这些信息显示在病毒的晶体或者冷冻电镜的高分辨率结构表面,我们看到各组抗体逃逸株病毒的突变位点,集中分布在病毒表面一些高度暴露的loop结构上,这些二级结构包括病毒VP1 BC loop(1081、1082、1085、1087),VP1的C端(1285、1293),VP2的EF loop(2137、2139、2142)和βB(2070),以及VP3的BC loop(3079)和EF loop(3144)的位置。从整个病毒的结构分布来看,这些突变位点集中在病毒衣壳蛋白表面的四个特定区域。综合上述信息,我们在EVD68病毒表面鉴定了4个功能上相对独立的中和性抗原位点I、II、III、IV,其中位点I定位在病毒的五次轴,位点II和位点III分别在在病毒Canyon结构南侧左右两边,位点IV在跨越不同protomer的二次轴和三次轴之间位置。通过对病毒中和性抗原位点的研究,加深了我们对EVD68病毒结构与功能的认识,同时对EVD68病毒株特异性中和抗体的产生,以及对病毒流行株多样性和病毒的进化的认识起到促进作用。