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副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是海产品引发食源性胃肠疾病的主要病原菌。随着水产品流通的加快,Vp引发中毒的食物不仅仅集中于海产品,由海产品加工不当和交叉污染引起的Vp食源性疾病流行己呈上升趋势,因此控制海产品中Vp的携带量显得尤为重要。目前,海产品中Vp减除措施主要有暂养和净化、温度处理、高压处理、辐射等,但是这些方法很难兼顾到除菌效果和海产品原有风味的维持。近年来有许多学者提出有机酸可以用于食物保鲜和储藏,因此有机酸和其它减菌方法的联合使用己成为控制食物中细菌载量的研究热点。细菌酸耐受细胞的形成是弱酸减菌化处理中的关键技术问题,但目前对Vp在弱酸性条件下的耐受机制尚不清楚。本文通过研究柠檬酸和温度对海产品中Vp的协同抑制作用,建立了海产品中Vp减菌化处理方法。该方法不仅有效降低了Vp的携带量,还保持了海产品的鲜度。同时研究了Vp在弱酸性条件下产生的酸耐受诱导反应,并探讨了Vp的酸耐受调控因子表达规律,为建立海产品中Vp的高效减菌技术提供了理论依据。1.有机酸和温度对海产品中副溶血性弧菌的减菌效应采用响应曲面分析法对Vp的减菌条件进行优化。对Vp死亡率影响因素进行单因素分析后,以Box-Benhnken设计(BBD)评价温度、时间、pH三个因素显著性和交互作用,得出Vp最佳减除条件为：温度55.5℃、时间25s、pH4.96。在该条件下,Vp死亡率的预测值为97.36%,在三文鱼模拟污染样品中验证该值达97.07%,并且该条件处理前后鱼肌原纤维蛋白的Ca2+-ATPase活性没有显著差异。2.副溶血性弧菌酸耐受诱导及其δ因子表达规律本研究选取6株不同来源Vp,将其分别在pH5.5和pH7.5环境中适应1h,再在pH4.0环境中胁迫1h,测定存活率。并在该条件下,采用相对定量法检测cadA、toxR基因以及10种潜在的δ因子的表达水平。结果发现菌株RIMD2210663和VP098经pH5.5环境适应的存活率比经pH7.5环境适应的存活率高,产生了酸耐受反应；菌株ATCC33847检测不到存活细胞,其它菌株虽有存活,但经pH5.5环境适应的存活率比经pH7.5环境适应的存活率低,没有产生酸耐受反应；cadA、VPA1690、VP2358基因在6种菌株中的表达均上调,VP2553、VPA1555、VP2210、VP2953基因表达上调的菌株能检测到存活细菌,toxR基因表达上调的菌株产生了酸耐受反应。大流行株RIMD2210663在不同pH适应处理1h后,再在pH4.0环境中胁迫1h后,测定其存活率,并检测cadA、toxR以及10种潜在的δ因子的表达水平,分析RIMD2210663在酸胁迫下相关基因的表达与适应pH和存活率的关系。结果表明所选目的基因都是低pH诱导表达的基因,其中cadA、VP2358、VP2578的表达受环境pH影响显著高于其它基因；cadA、toxR、VP0055、VPA1555、VPA1690、VP2232、VP2578、VP2670、VP2953基因在存活率达到2.91%时表达量最高；VP2358基因在存活率达到17.7%时表达量最高；VP2553的表达量随存活率的增加缓慢上升。不同pH适应条件对cadA、toxR以及δ因子诱导表达具有显著影响。虽然pH4.5和pH6.0适应条件都可以诱导酸耐受相关基因的表达,并且pH4.5诱导表达水平较高,但是它们都不能诱导菌株产生酸耐受反应。其主要原因是pH4.5适应阶段大部分Vp已经死亡；Vp虽然能在pH6.0适应阶段存活,但是酸耐受相关基因未被有效诱导表达,使细胞酸耐受能力不强,无法抵抗致死酸环境。3.VP2358在副溶血性弧菌酸耐受中的作用以RIMD2210663基因组为模板,PCR扩增VP2358上下游DNA序列,并以其为模板,通过重叠PCR获得VP2358上下游序列拼接片段。将拼接片段克隆入pMD20-T载体,成功构建重组质粒pMD-⊿VP2358。通过PstI单酶切,回收pMD-⊿VP2358中的VP2358上下游拼接片段,并将其与自杀质粒pDS132连接,连接产物转入s17感受态细胞,获得重组质粒pDS132-⊿VP2358。通过第一轮重组,筛选出含有pDS132-⊿VP2358质粒的RIMD2210663。将其通过第二轮重组,用氯霉素抗性LC平板反向筛选,结合靶基因内外引物PCR鉴定,成功构建出缺失株RIMD2210663⊿VP2358。将突变株RIMD2210663⊿VP2358及其野生株在pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH7.5,37℃环境中分别适应1h后,再在pH4.0,37℃环境中胁迫处理1h,测定存活率。结果表明,突变株经不同pH环境适应后,其对致死酸环境的抵抗力低于野生株。进一步研究显示,在酸适应过程中VP2358的缺失对δ因子和酸耐受基因的表达水平也产生了影响。将突变株和野生株在pH5.5环境中适应1h,再在pH4.0环境中胁迫1h后,以野生株为对照,检测突变株cadA、rpoS、toxR基因的相对表达水平。结果表明突变株cadA、rpoS、toxR基因的表达量分别是野生株的0.7、2.8、1.7倍。RIMD2210663⊿VP2358菌株经pH4.96、55.5℃、25s处理后,存活率显著低于野生株；但是经55.5℃、25s以及pH4.96、25s分别处理后,其存活率与野生株并无显著差异,这说明VP2358对RIMD2210663在酸和热联合作用条件下的存活具有显著影响。