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西妥昔单抗和帕尼单抗是表皮生长因子受体抑制剂,此类靶向治疗药物的出现,有效抑制了结直肠癌的发生发展,但西妥昔单抗和帕尼单抗的治疗受到EGFR下游RAS基因的影响,RAS突变型能自动活化通路并转导下游信号,所以只有RAS野生型患者才能对EGFR单抗的治疗产生良好效果。RAS突变中N-RAS突变仅占约2%,不容易受到研究重视,因此本文对N-RAS的突变检测进行研究。本文先通过N-RAS常见的17种突变位点,构建了N-RAS突变型和野生型的质粒,提取质粒后通过电泳观察条带颜色,颜色较亮,用nanodrop检测质粒浓度结果为40ng/μL。测序验证显示模板DNA序列与合成序列一致。采用Taqman探针荧光定量PCR技术,使用Primer Express 3.0软件设计野生型和突变型引物及探针,经过PCR反应体系优化后得出最佳反应体系的条件,引物终浓度为0.4μΜ/μL,探针终浓度为0.2μΜ/μL,模板DNA终浓度为1ng/μL,并以此建立单引物荧光定量PCR反应体系。单引物体系构建完成后分别用单引物验证其特异性,2号外显子12号密码子野生型模板荧光定量PCR的Ct值分别为:20.5456,20.0395,17.3253,17.5611,2号外显子13号密码子野生型模板荧光定量PCR的Ct值分别为26.2657,23.3040,26.7295,3号外显子61号密码子野生型模板荧光定量PCR的Ct值分别为27.2140,26.9111,21.9652,20.6787。在构建好的多引物体系中,,2号外显子12、13号外显子混合野生型模板荧光定量PCR的Ct值为18.027,3号外显子61号密码子野生型模板荧光定量PCR的Ct值为30.4719,以野生型Ct值为标准,进行突变型的荧光定量PCR,可根据Ct值的不同区分野生型和突变型。多引物体系进行以突变型DNA模板100%、10%、1%、0.1%、0系列浓度梯度进行灵敏度检测,数据结果显示可检测突变下限低于5%。通过已经构建的单引物荧光定量PCR突变检测体系,进一步构建多引物单引物荧光定量PCR突变检测体系,单引物荧光定量PCR体系用于多引物荧光定量PCR显示结果较好,所以采用引物终浓度为0.4μmol/μL,探针终浓度为0.2μM/μL,模板DNA终浓度为1ng/μL的PCR反应体系。