超声靶向破坏微泡（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是一种新的介导基因转染、药物摄取和载体递送的转移技术，具有靶向性、安全性、有效性和操作简便等优点。本课题组前期研究已证实，UTMD可安全、有效增强腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)体内外转染视网膜色素上皮细胞及组织，同时加快了AAV携带基因的表达。以上结果提示，UTMD不仅促进AAV进入细胞，还可能加快其在细胞内的运输。已有研究发现UTMD通过“声孔效应”促进载体穿过细胞膜进入细胞，但目前尚未见UTMD对细胞内转运影响的相关研究报道。本实验拟利用AAV为载体媒介，针对UTMD作用后细胞内运输行为进行观察和研究，以期进一步探索UTMD的机制，为此技术的拓展及优化应用提供实验基础。　　第一章：UTMD介导AAV为载体的基因转染方案优化　　目的:优化UTMD参数组合以期实现安全有效促进AAV转染。　　方法:携绿色荧光蛋白基因的重组2型AAV(rAAV2-EGFP)以浓度梯度自然转染人宫颈癌细胞HeLa，获得量效曲线。以前期研究UTMD优化参数为依据，选择参数包括超声功率、辐照时间、占空比和微泡体积比，罗列可能的6组参数组合，分别介导rAAV2-EGFP转染HeLa细胞。48h后，采用倒置荧光显微镜观察EGFP表达情况，流式细胞仪测定转染效率。采用CCK-8方法检测细胞活性。　　结果:选择rAAV2-EGFP剂量2000v.g./cell用以参数优化实验。UTMD优化参数组合为超声功率1W/cm2、辐照时间60s、占空比1∶5和微泡体积比1∶5。以优化的UTMD介导rAAV2-EGFP转染HeLa细胞，48h后，转染效率自15.39％±0.15％提升至24.97％±0.19％，提高百分率为62.25％。优化的UTMD参数对细胞生存率无显著损害（P=1.000）。　　结论:获得的UTMD优化参数可安全、有效提高AAV对HeLa细胞的转染，相应参数可用于下一步机制研究。　　第二章：UTMD介导AAV转染内吞受限细胞NIH/3T3　　目的:探索UTMD对小鼠成纤维细胞NIH/3T3（AAV转运内吞受限细胞）内AAV转运内吞障碍的影响。　　方法:rAAV2-EGFP以浓度梯度自然转染NIH/3T3细胞，获得量效曲线。根据AAV转染HeLa细胞和NIH/3T3细胞的转染效率的高低，分别选择低中高三个剂量，使用优化的UTMD参数，介导不同剂量的AAV转染HeLa细胞和NIH/3T3细胞。48h后，采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP表达情况。采用Real-timePCR和WesternBlotting测定EGFPmRNA含量及EGFP蛋白含量。采用CCK-8测定细胞活性。　　结果:转染HeLa细胞AAV的低中高剂量分别是1000v.g./cell、2000v.g./cell和4000v.g./cell。当AAV为中剂量(2000v.g./cell)时，UTMD可显著提高AAV对HeLa细胞的转染效率(P=0.002)和单细胞荧光强度（P=0.005），提高百分率分别为60.41％和58.20％;对低剂量及高剂量AAV无明显提高效果。转染NIH/3T3细胞的三个AAV剂量分别是1000v.g./cell、10000v.g./cell和500000v.g./cell。UTMD均可显著提高此三个剂量的AAV对NIH/3T3细胞的转染效率(118％，P=0.002;63.94％，P=0.002;11.65％，P=0.019)和单位细胞平均荧光强度(14.44％，P=0.009;34.37％，P=0.001;15.27％，P=0.025)。Real-timePCR结果显示，UTMD介导AAV为载体的EGFP基因转录在HeLa细胞和NIH/3T3细胞的提高倍数分别为1.62±0.11倍(P=0.001)和1.64±0.28倍（P=0.017）。Westernblotting结果显示，UTMD均能提高AAV携带的EGFP基因在HeLa细胞和NIH/3T3细胞的蛋白表达。优化的UTMD参数和AAV剂量未明显影响细胞活性（P＞0.05）。　　结论:与内吞正常细胞HeLa相比，UTMD增强AAV转染内吞受限细胞NIH/3T3无剂量限制性，但增强效果有限，提示UTMD有促进细胞内吞的可能性。　　第三章：UTMD介导AAV入胞及入核的研究　　目的:明确UTMD介导下，AAV病毒颗粒入胞和入核的进程与细胞内吞的关系。　　方法:检验UTMD参数和AAV剂量应用于共聚焦皿内HeLa细胞的有效性。采用免疫荧光共聚焦显微镜观察UTMD介导rAAV2-EGFP转染后10min、45min、2h和24h，AAV病毒颗粒在细胞浆和细胞核内的分布和数量。选择AAV在细胞内明显增多的时间点，Real-timePCR检测细胞内所含基因数量以验证UTMD对AAV转运的增强，核浆分离后分别WesternBlotting测定AAV病毒衣壳数量以验证UTMD对AAV入胞和入核的增强。以上实验所设对照组均为自然转染的AAV组。　　结果:UTMD显著提升AAV对培养于共聚焦皿玻底的HeLa细胞的转染效率，自16.98％±0.38％提升至27.93％±1.40％（P=0.000）。共聚焦结果显示，UTMD作用后45min和2h，UTMD明显增多AAV进入胞浆的数量;转染后2h，AAV进入胞核的数量明显增多。Real-timePCR结果显示，转染后45min和2h，UTMD均能显著增加AAV入细胞的基因数量（分别是P=0.001和P=0.031），提高倍数分别为1.45±0.08倍和1.46±0.13倍。WesternBlotting结果显示，转染后45min，UTMD显著增多AAV入胞和入核的衣壳蛋白含量;转染后2h，增多不明显。　　结论:UTMD增强AAV转运的高峰位于转染后45min，与细胞内吞的高峰时间重叠，提示UTMD有可能促进了细胞内吞。　　第四章：UTMD增强AAV转染与细胞内吞的关系　　目的:明确UTMD对AAV转染的增强作用与网格蛋白介导的细胞内吞的关系。　　方法:UTMD介导AAV转染后45min和2h，免疫荧光共聚焦显微镜观察HeLa细胞浆内网格蛋白的表达和在细胞膜上的聚集，与未处理细胞（control组）、AAV转染细胞（AAV组）和UTMD处理细胞（UTMD组）比较，分析UTMD对网格蛋白表达和聚集的影响。UTMD介导AAV转染后45min和2h，Westernblotting测定HeLa细胞内网格蛋白的含量，与AAV组和UTMD组比较，分析UTMD对网格蛋白表达的影响。UTMD介导AAV转染后45min，透射电镜观察HeLa细胞膜内侧面内吞泡的形态和数量，与control组和AAV组比较，分析UTMD对内吞泡形成的影响。使用氯丙嗪(CPZ)抑制细胞网格蛋白介导的内吞，UTMD介导rAAV2-EGFP转染，48h后，倒置荧光镜观察EGFP表达，流式细胞仪测定转染效率。　　结果:免疫荧光共聚焦显示，与AAV自然转染相比，UTMD单独作用后45min和2h，胞浆内网格蛋白荧光强度明显增强，细胞膜上网格蛋白聚集颗粒明显增多;当UTMD联合AAV后，以上增强效果更加明显。WesternBlotting证实，在作用后的45min，与AAV自然转染的细胞相比，单独UTMD及UTMD+AAV作用后细胞内网格蛋白表达水平明显提高。进一步利用透射电镜观察细胞膜内侧面内吞泡，结果显示，在作用后45min，与未处理细胞及AAV自然转染的细胞相比，UTMD+AAV处理的细胞内侧面有包裹的内吞泡及无包裹的内吞泡明显增多。使用CPZ后，AAV组及UTMD+AAV组的转染率均显著下降（分别是5.12％，P=0.001和8.79％，P=0.024），但抑制后的UTMD+AAV组转染率仍高于抑制后的AAV组。　　结论:UTMD单独作用可增强细胞内吞泡的形成及对应网格蛋白的聚集，当联合AAV后，此效应更为明显;抑制内吞后尚不能完全阻抑UTMD促进AAV转染的效果。所以，促进内吞是UTMD介导细胞摄取载体的机制之一。