链格孢菌(Alternaria alternata (Fr.) Keissler)被确认为恶性外来杂草紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng.)植株上的自然致病菌,具有发展成为生物除草剂防除紫茎泽兰的潜力。进一步研究发现其产生的毒素具有较强的除草活性,但是,其产生量较低,经过生物发酵没有商业化前景。为了能够高效利用该菌的代谢物,需要研究其代谢过程以及与其有关的基因。本实验室前期通过限制性内切酶介导整合法(REMI)获得了与野生型相比,产毒力显著下降的链格孢菌突变株001。本文通过将链格孢菌野生型和突变体001比较研究,以突变体001中因被质粒pSH75插入而打断的基因为切入点,在克隆了敲除基因HP001和下游Gβ基因的基础上,比较研究了这两个基因在不同条件下的表达模式和造成表达差异的原因,并通过酵母双杂交法钓取HP001基因的互作蛋白,以揭示该基因的作用机理,再运用抑制性消减杂交法筛选出链格孢菌野生型和突变体中表达差异基因,进一步阐明该物种的产毒代谢分子机制,为通过基因重组技术改进毒素代谢效率,将链格孢菌发展为生物除草剂提供理论基础。本研究的主要结果如下：1.链格孢菌弱产毒突变体001中敲除基因的克隆根据已知的质粒pSH75的插入边缘序列,使用锚定PCR法克隆得到突变体中敲除基因的部分序列,经比对,获得了一段长为485bp的片段,插入位点位于质粒的多克隆位点处,排除与质粒上的序列相似性后,可以确定其为链格孢菌突变体中被质粒pSH75打断基因的部分序列。进一步运用锚定PCR法和RACE法获得HP001基因的全长DNA和cDNA序列,序列分析HP001基因DNA序列全长2775bp,由一个内含子和2个外显子组成,HP001基因编码区cDNA序列全长1326bp,编码442个氨基酸,与小麦德氏菌(Pyrenophora tritici-repentis)的抑制型酸性磷酸酶同源性最高(84%),比对中与各种真菌的组氨酸磷酸酶基因出现同源性的概率最高,其分子量约为49.1 Kda。虽然HP001基因不含有组氨酸磷酸酶家族的RHG结构域,但是其具有该家族的保守区域和功能激活域,因此仍可以将HP001基因归类于组氨酸磷酸酶家族。以HP001基因片段为探针,进行Southern blot杂交,检测出野生型中该基因为单拷贝,突变体001中该基因所在片段比野生型中大,这暗示是由于质粒插入所导致的片段增长,以潮霉素基因为探针验证了质粒pSH75单拷贝插入到了HP001基因上,插入位点为HP001基因(总DNA序列)的1130bp处。2-链裆匏菌野生型和突变体001的产毒代谢差异的机制比较了链格孢菌野生型和突变体001生长特性差异,发现与链格孢菌野生型相比,突变体在PDA培养基上的生长速率没有显著差异,对不同成分的培养基的反应有大致相似的趋势,这表明HP001基因是非生长必须因子；但是突变体的产孢量与野生型相比显著下降了70%,说明HP001基因与产孢相关。在液体培养基中(PSK),突变体延迟出现黑化老熟现象,并且该基因的缺失会导致菌株对碳源的利用率下降；链格孢菌野生型菌块接种在叶片上培养3天后形成明显病斑,而突变体001几乎无明显病斑,则直接表明了HP001基因调控链格孢菌的产毒致病；链格孢菌野生型和突变体001的孢子在洋葱表皮上都可以正常萌发,但在紫茎泽兰叶片上,突变体萌发率较低,则表明HP001基因的缺失并不会影响孢子的萌发,但是影响到菌株的入侵行为,使孢子萌发产生的菌丝不能有效入侵植物体,失去致病性；链格孢菌野生型在低磷酸浓度条件下,不能正常生长,而突变体无影响,且其培养基中的磷酸酶活性显著高于野生型,说明HP001基因被阻断后可能激活了某个磷酸抑制型基因,且该基因编码分泌型酸性磷酸酶。分别在液体培养和叶片生长条件下比较野生型和突变体的HP001基因的表达差异。结果表明：在液体培养(PSK)条件下该基因的表达随时间呈上升趋势,至第6天达到峰值其后下降,与前期毒素产生的动态研究结果相一致,表明HP001基因的表达与毒素的产生存在线性关系；为了进一步研究该基因的表达特性,将野生型菌株分别接种于4种生长介质上,即紫茎泽兰的表皮、揭去表皮后的紫茎泽兰叶肉组织以及蒸馏水或紫茎泽兰汁液的滤纸上,研究结果表明,在后两者培养条件下,HP001基因的表达处于低水平且无显著变化,而在叶片上该基因有明显的表达,在10小时达到最大值,但是,在完整表皮上的表达量明显高于在叶肉组织上的。菌块接种在受损的叶片上,HP001基因的表达量同样在10小时最大,且表达量高于PSK培养基内生长24小时时该基因的表达量,其后表达量急剧下降,并在18至48小时之内基因表达量变化不大,至60小时时表达量略有升高,这表明HP001基因在侵染初期特异性表达,与链格孢菌的致病性密切相关。运用RACE法从链格孢菌野生型中获得Gβ基因的cDNA序列,分析其序列发现：该基因编码区全长序列1056bp,编码352个氨基酸,与玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的Gβ基因同源性最高(达88%)。分别在在液体培养条件下(PSK)和叶片生长条件下,比较链格孢菌野生型和突变体中Ga和Gβ基因的表达情况,发现这两种情况下,野生型和突变体001中这两种基因的表达都存在差异,不过液体培养条件下Gα亚基和Gβ基的表达情况并不规律,在生长的前两天时在野生型中的表达量比在突变体中略低,但在第三天突然升高,其后又降低并在第五天再次升高。总体看来,后三天时Gα亚基和Gβ亚基在野生型中的表达量都高于突变体,表达趋势基本一致,但是在突变体Gβ基的表达量的下降程度大于Gα亚基。而在叶片上生长时,突变体001中Gα亚基和Gβ基的表达量明显低于野生型,Gβ亚基的表达量下降的程度也更大。这表明HP001基因的缺失对G蛋白信号途径的基因表达产生了影响,且对Gβ亚基基因表达的影响高于对Gα亚基的影响。3.链格孢菌HP001基因的互作蛋白研究构建了链格孢菌酵母双杂交文库,以HP001基因为诱饵蛋白,筛选文库,获得79个蓝斑,对测序结果进行分析,找到融合于GAL4AD序列后的开放阅读框,共发现了3种蛋白序列,对其进行分析发现：编码的开放阅读框分别编码94、79和131个氨基酸,经比对这3种蛋白分别为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和糖基水解酶(GLYH),它们都与小麦德氏菌同源性最高,分别达95%、94%和94%。6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)为戊糖磷酸途径的组成成员,3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖分解途径的主要组成蛋白,而糖基水解酶(GLYH)属于细胞壁降解酶和果胶降解酶类,这3种酶均为不同代谢途径的成员,但可能都是与产毒、侵染相关的毒力因子。4.链格孢菌野生型和突变体001中表达差异基因的研究构建了链格孢菌抑制性消减杂交文库,分别以突变体为对照样本,野生型为检测样本建立正向杂交文库；以野生型为对照样本,突变体为检测样本建立反向杂交文库筛选其中表达差异基因。正向杂交库筛选到了27个差异显著杂交斑点,反向杂交库筛选到了26个差异显著杂交斑点,正向杂交库中含有磷酸甘油酸激酶、细胞分裂蛋白酶、乙二醛氧化酶和海藻糖磷酸化酶等,反向杂交库中含有乙醇脱氢酶、细胞色素氧化酶亚基和黄质血红素蛋白等。此外,这2个杂交库中都还有若干假定蛋白和未知基因。最后,仅随机挑选正向杂交库中筛选到的几个基因进行进一步验证,结果发现F28(未知基因)、F75(核糖体蛋白)和F110(乙二醛氧化酶)在野生型中特异表达,在突变体中无表达。