小鹅瘟是鹅细小病毒(GPV)感染的一种传播快、死亡率高的高度接触性传染病,以渗出性肠炎、肝、肾、心等实质器官炎症为特征,对5-13日龄的雏鹅发病率和死亡率可达100%,是目前危害养鹅业的主要疾病之一。近年来,本病在世界各地均有不同程度的流行,广泛发生于中国、欧洲各国、以色列、越南和日本等地。目前,用于防治该病的疫苗主要为弱毒苗和油乳剂灭活苗。弱毒苗价格低、效果好,但易导致病毒散播;灭活苗虽然安全,又能激发良好的体液免疫反应,但不足之处是使用剂量大,且不能诱发机体产生细胞免疫,而一系列的研究证实在疾病的免疫保护中,细胞免疫和体液免疫均占有重要的地位。核酸疫苗的出现给小鹅瘟的免疫预防带来了新的希望,但研究也发现核酸疫苗也存在许多不足之处:如免疫原性不强、质粒DNA可能整合到宿主DNA上引起病理和毒理反应等。因此,如何增强核酸疫苗的免疫效果成为目前该疫苗研究的关键。随着人们对IL-2等细胞因子的深入研究,发现其具有明显的分子佐剂效应,能特异性增强抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性。VP2是鹅细小病毒结构蛋白之一,是GPV的重要保护性抗原,可刺激机体产生中和抗体,与主要结构蛋白VP3存在相同的抗原决定簇,是制备核酸疫苗的重要候选基因。本试验参考GenBank发表的GPV-B株全基因序列,设计特异性引物,采用PCR方法扩增出GPV病毒的VP2基因,然后与鹅源性白细胞介素-2基因(Goose Interleukin-2)构建成融合基因VP2-IL-2,将该融合基因克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)中,构建出pCDNA3.1(+)-VP2-IL-2重组质粒,最后将构建的核酸疫苗免疫小白鼠,比较其诱导小鼠细胞免疫发生能力的差异,以期探讨IL-2对GPV核酸疫苗是否有免疫增强作用。并为进一步研究和开发小鹅瘟DNA疫苗提供科学依据。1.重组质粒pCDNA3.1(+)-VP2的构建根据GeneBank公布的鹅细小病毒(GPV)GPV-B株全基因序列设计特异性引物,在GPV VP2基因引物上游引入BamHⅠ位点、下游引入XhoⅠ位点。以鹅细小病毒DNA为模板,PCR扩增出VP2完整基因。再与pMD18-T质粒载体连接,转化入感受态细胞DH5a,提取重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定为阳性克隆后,与真核表达载体相连,构建了重组质粒pCDNA3.1(+)-VP2。2.重组质粒pCDNA3.1(+)-VP2-IL-2的构建根据GeneBank公布的鹅细小病毒(GPV)GPV-B株全基因序列和鹅源性白细胞介素-2(IL-2)基因序列分别设计特异性引物,且在GPV VP2基因引物上游引入BamHⅠ位点、下游引入SalⅠ位点,在IL-2基因引物上游引入SalⅠ位点、下游引入XhoⅠ、HindⅢ位点。先RT-PCR扩增上游带有SalⅠ位点、下游带有XhoⅠ、HindⅢ位点的鹅源IL-2基因,并将其克隆到pMD18-T中。再以鹅细小病毒DNA为模板,PCR扩增VP2基因,将其插入到含有IL-2基因的质粒pMD18T-IL-2中,使两个基因首尾相连,且VP2基因不含终止密码子,IL-2基因不含起始密码子。最后将VP2-IL-2融合基因插入真核表达载体pCDNA3.1(+),构建了重组质粒pCDNA3.1(+)-VP2-IL-2。3.小白鼠免疫试验我们将试验小鼠随机分成5组,每组8只,分别为:pCDNA3.1(+)-VP2-IL-2核酸疫苗组(Ⅰ组)、pCDNA3.1(+)-VP2核酸疫苗组(Ⅱ组)、GPV弱毒疫苗组(Ⅲ组)、空载体pCDNA3.1(+)组(Ⅳ组)、空白对照组(灭菌生理盐水)(Ⅴ组)。接种途径为肌肉注射(100ug/只),首免后间隔14天进行第二次免疫,二免后两周进行第三次免疫,三免后两周,放血分离血清。通过间接ELISA检测,比较其诱导小鼠细胞免疫发生能力的差异。其结果为:核酸疫苗诱导免疫小鼠产生细胞免疫的能力总体较GPV弱毒疫苗强。一免后,核酸疫苗免疫组(Ⅰ、Ⅱ)IL-4、IFN-γ水平均显著极差异(P＜0.01)高于GPV弱毒疫苗组(Ⅲ组),GPV弱毒疫苗组(Ⅲ组)显著极差异(P＜0.01)高于空载体组(Ⅳ)和灭菌生理盐水(Ⅴ组)。二免后,pCDNA3.1(+)-VP2-IL-2核酸疫苗组(Ⅰ组)IL-4、IFN-γ水平极显著(P＜0.01)高于pCDNA3.1(+)-VP2核酸疫苗组(Ⅱ组)。这表明,核酸疫苗组(Ⅰ、Ⅱ)比GPV弱毒疫苗组(Ⅲ)诱导免疫小鼠产生细胞免疫的能力强,且融合基因组较单基因组能产生更强的细胞免疫。