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本文主要从以下几方面进行论述:
第一部分 ESR1/2可影响NSCLC中重要的膜受体信号通路
目的:基于TCGA NSCLC基因表达数据分析,探究ESR1/2对NSCLC基因表达谱的影响。
方法:从UCSC Xena在线数据库获取TCGANSCLC基因表达数据集,采用R软件包“limma”进行基因差异表达分析,评估ESR1/2表达水平高低对NSCLC肿瘤组织样本中其他基因的表达的影响;筛选出差异表达基因(differential expression genes, DEGs),将DEGs作为目标基因集,采用在线工具DAVID Functional Annotation Tool进行基因本体(Gene ontology,GO)功能和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路注释,初步探讨ESR1/2对NSCLC关键分子事件和信号通路的潜在影响。
结果:差异表达分析结果显示有1237个基因在不同ESR1水平下具有显著的表达差异(∣Log2FC∣>1且p<0.05)。GO功能和KEGG通路富集结果显示,High-ESR1组中769个表达上调的DEGs主要富集于信号转导、免疫和炎症响应、细胞粘附、受体结合和激活等项中。High-ESR1组中468个表达下调的DEGs主要富集于转录调控、氧化还原过程、钙离子结合、CYP450相关代谢等项中。对于ESR2,有102个DEGs被筛选出来,High-ESR2组中95个上调的DEGs主要富集于细胞粘附、肢体形态发生、上皮细胞分化、钙离子结合、结构分子活性和GABA能神经突触等项中。High-ESR2组中7个下调的 DEGs的富集分析无显著性结果。对于 GO功能的细胞组分,ESR1和ESR2组中的DEGs均主要富集于质膜和细胞外空间。此外,富集于上述GO和KEGG项中的 DEGs还参与许多膜受体信号传导通路,如生长因子信号通路、Wnt/GSK/β-Catenin通路和Notch通路。
结论:ESR1/2可能影响NSCLC中许多重要的分子事件和信号通路,尤其是膜相关的细胞通讯相关过程,包括受体激活、信号转导、细胞粘附、免疫反应等。更为关键的提示是ESR1/2可能通过调节重要的膜受体信号通路来影响NSCLC的发生发展。因此,在接下来的研究中,我们将验证 ERs对 EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路的调节作用及对NSCLC进展的影响。
第二部分 ERs调节膜受体信号网络促进NSCLC的发生发展
目的:探究 ERs对 NSCLC细胞行为的影响,以及 ERs对 EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路和由此构成的信号网络的调节作用。
方法:(1)不同浓度的17β-E2(0、10、20 nM)处理细胞72 h之后,CCK-8检测各NSCLC细胞株的增殖情况;Western Blot检测各细胞株中ERα和ERβ的表达情况。
(2)在PC9/G和H1299细胞中转染si-ERα/si-ERβ后,Western Blot检测沉默ERs对凋亡相关蛋白、迁移侵袭相关蛋白表达的影响;转染 si-ERα/si-ERβ或氟维司群(Fulvestrant,Ful)预处理后,吉非替尼(Gefitinib,Gef)或空白对照二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)孵育细胞48 h,流式细胞术检测沉默ERs对细胞凋亡比率的影响,Transwell检测ERs对细胞迁移侵袭能力的影响。
结果:1. ERs促进NSCLC细胞增殖、迁移侵袭和凋亡逃逸
(1)E2处理显著增强了PC9/G、PC9与H1299细胞的增殖能力(p<0.05),但对A549、H1975与HCC827细胞的增殖没有影响;ERα与ERβ在PC9/G、PC9与H1299细胞中显著高表达,而在A549、H1975与HCC827细胞中的表达水平相对较低。
(2) si-ERα与si-ERβ分别沉默ERα和ERβ后,均可增加PC9/G和H1299细胞的凋亡(p<0.05);且与单用Gefitinib相比,si-ERs与Gefitinib联合可显著提高PC9/G和H1299细胞的凋亡率(p<0.05)。si-ERα与si-ERβ均可下调PC9/G和H1299细胞中Survivin和Bcl-2的表达(p<0.05),上调Cleaved Caspase3的表达(p<0.05)。Bim的表达在PC9/G细胞中被si-ERs上调(p<0.05),在H1299细胞中不受影响。
2. ERs调节EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路中关键节点蛋白的表达和活化
(1) si-ERs下调PC9/G和H1299细胞中Notch1、NICD、Hes1和β-Catenin的表达(p<0.05)。si-ERs还下调H1299细胞中GSK3β的表达同时上调GSK3β的磷酸化(p<0.05)。PC9/G细胞中GSK3β与pGSK3β的表达水平未受到si-ERs的影响。
(2)PC9/G细胞中,E2(10、20 nM)可上调ERα与ERβ的表达(p<0.05)。E2也调节Notch1通路关键蛋白的表达。10或20 nME2可同时上调Notch1、NICD和Hes1的表达(p<0.05);而高浓度的E2(50 nM)上调Hes1表达(p<0.05),下调Notch1的表达(p<0.05),对NICD的表达没有明显影响。E2可以小幅度上调β-Catenin的表达(p<0.05),但并不影响GSK3β的表达。
3.膜受体信号网络模型的构建和模拟仿真
(1)基于EGFR、Notch1和GSK3β/β-Catenin通路相关蛋白的经时表达数据构建了ERs、EGFR、Notch1和GSK3β/β-Catenin通路串话的常微分方程(Ordinary differential equations,ODEs)模型,得到的信号网络包括66个反应,43个节点和98个参数。当EGF,E2和Dll1均处于低水平(All low group)时,模型输出维持在低水平。
(2)模型预测显示,即使EGFR通路被抑制,ERs的过度活化也会重新激活EGFR,从而导致EGFR TKI耐药。实验证实Gefitinib和Fulvestrant联合作用于NSCLC细胞显示出更好的肿瘤抑制效果;对于Gefitinib耐药的PC9/G和H1299细胞,沉默ERs也可增强Gefitinib的促凋亡和抑制迁移侵袭效果。
结论:(1)雌激素在NSCLC中的促增殖作用是ERs依赖的;(2)ERs调节促存活蛋白和促凋亡蛋白的平衡从而抑制NSCLC细胞凋亡;(3)ERs通过调节EMT过程促进NSCLC细胞的迁移和侵袭;(4)ERs增强 Notch1通路蛋白的表达和活化,并通过GSK3β或其他旁路途径增加β-Catenin蓄积;(5)17β-E2在一定浓度范围内可增强ERs、Notch1通路相关蛋白与β-Catenin的表达,Fulvestrant的作用则刚好与17β-E2相反;(6)ERs作为EGFR和Notch1通路的冗余途径在信号网络中起促癌作用,EGFR和Notch1通路被抑制时,ERs可重新激活信号网络并介导高水平的输出,从而促进NSCLC进展;(7)ERs信号的冗余性加剧了EGFR TKI耐药,联合抑制ERs可作为克服NSCLC EGFRTKI耐药的潜在策略。
第三部分 ERs、EGFR和Notch1联合高表达与NSCLC不良预后相关
目的:探究ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达水平与NSCLC预后的关系。
方法:IHC检测人NSCLC组织芯片中ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达,Kaplan-Meier方法分析ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达水平与生存期之间的关系。
结果:(1)ERα、ERβ与EGFR在NSCLC癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织(p=0.0019,p<0.0001,p=0.0009)。ERα、ERβ、EGFR与Notch1在癌组织的IHC评分均高于癌旁组织(ERα:p<0.0001;ERβ:p<0.0001;EGFR:p=0.0053;Notch1:p=0.0052)。(2)ERα、ERβ、EGFR、Notch1的表达水平与NSCLC早期患者的生存期无关,但ERα、ERβ、EGFR在中晚期NSCLC患者中的高表达与更差的10年生存期有关(p=0.0487;p=0.0419;p=0.0422)。(3)ERα、ERβ与EGFR三者中,同时高表达的受体越多,中晚期NSCLC患者的生存期越差(p=0.0042)。(4)ERα、ERβ与EGFR三者中至少二者高表达的中晚期NSCLC患者中,Notch1高表达与更差的生存期有关(p=0.0404)。
结论:ERα、ERβ、EGFR与Notch1均在NSCLC癌组织中表达增强,他们均可能是NSCLC的不良预后因子。ERα、ERβ、EGFR与Notch1的高表达可联合促进NSCLC的不良预后。
第一部分 ESR1/2可影响NSCLC中重要的膜受体信号通路
目的:基于TCGA NSCLC基因表达数据分析,探究ESR1/2对NSCLC基因表达谱的影响。
方法:从UCSC Xena在线数据库获取TCGANSCLC基因表达数据集,采用R软件包“limma”进行基因差异表达分析,评估ESR1/2表达水平高低对NSCLC肿瘤组织样本中其他基因的表达的影响;筛选出差异表达基因(differential expression genes, DEGs),将DEGs作为目标基因集,采用在线工具DAVID Functional Annotation Tool进行基因本体(Gene ontology,GO)功能和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路注释,初步探讨ESR1/2对NSCLC关键分子事件和信号通路的潜在影响。
结果:差异表达分析结果显示有1237个基因在不同ESR1水平下具有显著的表达差异(∣Log2FC∣>1且p<0.05)。GO功能和KEGG通路富集结果显示,High-ESR1组中769个表达上调的DEGs主要富集于信号转导、免疫和炎症响应、细胞粘附、受体结合和激活等项中。High-ESR1组中468个表达下调的DEGs主要富集于转录调控、氧化还原过程、钙离子结合、CYP450相关代谢等项中。对于ESR2,有102个DEGs被筛选出来,High-ESR2组中95个上调的DEGs主要富集于细胞粘附、肢体形态发生、上皮细胞分化、钙离子结合、结构分子活性和GABA能神经突触等项中。High-ESR2组中7个下调的 DEGs的富集分析无显著性结果。对于 GO功能的细胞组分,ESR1和ESR2组中的DEGs均主要富集于质膜和细胞外空间。此外,富集于上述GO和KEGG项中的 DEGs还参与许多膜受体信号传导通路,如生长因子信号通路、Wnt/GSK/β-Catenin通路和Notch通路。
结论:ESR1/2可能影响NSCLC中许多重要的分子事件和信号通路,尤其是膜相关的细胞通讯相关过程,包括受体激活、信号转导、细胞粘附、免疫反应等。更为关键的提示是ESR1/2可能通过调节重要的膜受体信号通路来影响NSCLC的发生发展。因此,在接下来的研究中,我们将验证 ERs对 EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路的调节作用及对NSCLC进展的影响。
第二部分 ERs调节膜受体信号网络促进NSCLC的发生发展
目的:探究 ERs对 NSCLC细胞行为的影响,以及 ERs对 EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路和由此构成的信号网络的调节作用。
方法:(1)不同浓度的17β-E2(0、10、20 nM)处理细胞72 h之后,CCK-8检测各NSCLC细胞株的增殖情况;Western Blot检测各细胞株中ERα和ERβ的表达情况。
(2)在PC9/G和H1299细胞中转染si-ERα/si-ERβ后,Western Blot检测沉默ERs对凋亡相关蛋白、迁移侵袭相关蛋白表达的影响;转染 si-ERα/si-ERβ或氟维司群(Fulvestrant,Ful)预处理后,吉非替尼(Gefitinib,Gef)或空白对照二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)孵育细胞48 h,流式细胞术检测沉默ERs对细胞凋亡比率的影响,Transwell检测ERs对细胞迁移侵袭能力的影响。
结果:1. ERs促进NSCLC细胞增殖、迁移侵袭和凋亡逃逸
(1)E2处理显著增强了PC9/G、PC9与H1299细胞的增殖能力(p<0.05),但对A549、H1975与HCC827细胞的增殖没有影响;ERα与ERβ在PC9/G、PC9与H1299细胞中显著高表达,而在A549、H1975与HCC827细胞中的表达水平相对较低。
(2) si-ERα与si-ERβ分别沉默ERα和ERβ后,均可增加PC9/G和H1299细胞的凋亡(p<0.05);且与单用Gefitinib相比,si-ERs与Gefitinib联合可显著提高PC9/G和H1299细胞的凋亡率(p<0.05)。si-ERα与si-ERβ均可下调PC9/G和H1299细胞中Survivin和Bcl-2的表达(p<0.05),上调Cleaved Caspase3的表达(p<0.05)。Bim的表达在PC9/G细胞中被si-ERs上调(p<0.05),在H1299细胞中不受影响。
2. ERs调节EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路中关键节点蛋白的表达和活化
(1) si-ERs下调PC9/G和H1299细胞中Notch1、NICD、Hes1和β-Catenin的表达(p<0.05)。si-ERs还下调H1299细胞中GSK3β的表达同时上调GSK3β的磷酸化(p<0.05)。PC9/G细胞中GSK3β与pGSK3β的表达水平未受到si-ERs的影响。
(2)PC9/G细胞中,E2(10、20 nM)可上调ERα与ERβ的表达(p<0.05)。E2也调节Notch1通路关键蛋白的表达。10或20 nME2可同时上调Notch1、NICD和Hes1的表达(p<0.05);而高浓度的E2(50 nM)上调Hes1表达(p<0.05),下调Notch1的表达(p<0.05),对NICD的表达没有明显影响。E2可以小幅度上调β-Catenin的表达(p<0.05),但并不影响GSK3β的表达。
3.膜受体信号网络模型的构建和模拟仿真
(1)基于EGFR、Notch1和GSK3β/β-Catenin通路相关蛋白的经时表达数据构建了ERs、EGFR、Notch1和GSK3β/β-Catenin通路串话的常微分方程(Ordinary differential equations,ODEs)模型,得到的信号网络包括66个反应,43个节点和98个参数。当EGF,E2和Dll1均处于低水平(All low group)时,模型输出维持在低水平。
(2)模型预测显示,即使EGFR通路被抑制,ERs的过度活化也会重新激活EGFR,从而导致EGFR TKI耐药。实验证实Gefitinib和Fulvestrant联合作用于NSCLC细胞显示出更好的肿瘤抑制效果;对于Gefitinib耐药的PC9/G和H1299细胞,沉默ERs也可增强Gefitinib的促凋亡和抑制迁移侵袭效果。
结论:(1)雌激素在NSCLC中的促增殖作用是ERs依赖的;(2)ERs调节促存活蛋白和促凋亡蛋白的平衡从而抑制NSCLC细胞凋亡;(3)ERs通过调节EMT过程促进NSCLC细胞的迁移和侵袭;(4)ERs增强 Notch1通路蛋白的表达和活化,并通过GSK3β或其他旁路途径增加β-Catenin蓄积;(5)17β-E2在一定浓度范围内可增强ERs、Notch1通路相关蛋白与β-Catenin的表达,Fulvestrant的作用则刚好与17β-E2相反;(6)ERs作为EGFR和Notch1通路的冗余途径在信号网络中起促癌作用,EGFR和Notch1通路被抑制时,ERs可重新激活信号网络并介导高水平的输出,从而促进NSCLC进展;(7)ERs信号的冗余性加剧了EGFR TKI耐药,联合抑制ERs可作为克服NSCLC EGFRTKI耐药的潜在策略。
第三部分 ERs、EGFR和Notch1联合高表达与NSCLC不良预后相关
目的:探究ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达水平与NSCLC预后的关系。
方法:IHC检测人NSCLC组织芯片中ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达,Kaplan-Meier方法分析ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达水平与生存期之间的关系。
结果:(1)ERα、ERβ与EGFR在NSCLC癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织(p=0.0019,p<0.0001,p=0.0009)。ERα、ERβ、EGFR与Notch1在癌组织的IHC评分均高于癌旁组织(ERα:p<0.0001;ERβ:p<0.0001;EGFR:p=0.0053;Notch1:p=0.0052)。(2)ERα、ERβ、EGFR、Notch1的表达水平与NSCLC早期患者的生存期无关,但ERα、ERβ、EGFR在中晚期NSCLC患者中的高表达与更差的10年生存期有关(p=0.0487;p=0.0419;p=0.0422)。(3)ERα、ERβ与EGFR三者中,同时高表达的受体越多,中晚期NSCLC患者的生存期越差(p=0.0042)。(4)ERα、ERβ与EGFR三者中至少二者高表达的中晚期NSCLC患者中,Notch1高表达与更差的生存期有关(p=0.0404)。
结论:ERα、ERβ、EGFR与Notch1均在NSCLC癌组织中表达增强,他们均可能是NSCLC的不良预后因子。ERα、ERβ、EGFR与Notch1的高表达可联合促进NSCLC的不良预后。