第一部分结直肠癌发生发展相关长非编码RNA的筛选及鉴定　　背景: 结直肠癌是威胁我国人民健康的最主要的恶性肿瘤之一。近年来，全基因组关联分析(genome wide association studies，GWAS)研究的广泛开展，从人类基因组中海量的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）这一角度发现了大量影响结直肠癌发生发展的热点区域，深入解析热点区域的功能及分子机制成为当前研究热点。长非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可在表观遗传学、转录及转录后等多个水平调控生理、病理过程，为解析热点区域功能及分子机制提供了新的视角。本研究旨在结合GWAS研究发现的热点区域筛选并鉴定结直肠癌发生发展相关lncRNA。　　方法: 数据库检测和生物信息学分析:检索GWAS catalog中结直肠癌相关的SNP位点以及lncRNA数据库信息。确定结直肠癌相关SNP100Kb范围内的lncRNA。对随机抽选的20对结直肠患者标本中差异表达lncRNA进行qRT-PCR验证。　　结果: 检索NHGRI GWAS catalog，结合Ensembl、GenBank、UCSC等在线数据库，查找出33个潜在的与结直肠癌发生发展相关的lncRNA。应用高通量多数据集在线分析平台——lncRNAtor，对上述lncRNA在结直肠癌组织中的表达丰度进行分析，进一步筛选获得8个拟验证lncRNA，分别为CCAT2(ENSG00000280997)、前列腺癌相关非编码RNA1(prostate cancer non-codingRNA1,PRNCR1)、ENSG00000258057、ENSG00000235641、ENSG00000251191、ENSG00000231208、ENSG00000248479、ENSG00000236823。行qRT-PCR检测了该8个lncRNA的组织水平，除已发表的CCAT2外，PRNCR1在肿瘤组织中平均上调约11.63倍且均一性最好。UCSC在线分析显示lncRNA PRNCR1位于8号染色体短臂2区，长度约为13kb。　　结论: 我们综合了GWAS catalog中结直肠癌相关的SNP位点以及lncRNA数据库的检索结果，从中筛选出的lncRNA PRNCR1在结直肠癌中上调最高且均一性好，提示PRNCR1可能在结直肠癌中起着重要的作用，可能是潜在促癌基因，值得深入探讨。　　第二部分 lncRNA PRNCR1在结直肠癌中的表达特征及生物学功能　　背景: 目前，lncRNA是众多疾病尤其是肿瘤领域的研究热点，在诸多的生物过程中发挥着重要功能;因此，它的特征及功能不断被探索。在结直肠癌中，lncRNA PRNCR1的异常表达可能与结直肠癌有关，但其特异性作用方式仍未知。因此，我们探讨了PRNCR1高表达与结直肠癌多种临床病理特征之间的关系，并在体外和体内通过ASO介导的等抑制技术对PRNCR1在肠癌中的增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物功能进行了探讨，并且分析了PRNCR1上调与肠癌预后的之间的关系。　　方法: 入组63例经病理确诊为结直肠癌患者的癌组织及癌旁组织，qRT-PCR法检测PRNCR1的表达水平。设计合成PRNCR1的ASO，通过脂质体介导的转染法转入HT-29、SW480细胞株，qRT-PCR法检测干扰后HT-29、SW480细胞株内PRNCR1的转录水平。实验分为Scramble转染对照组和PRNCR1-ASO转染组:CCK8实验检测PRNCR1低表达对增殖活性的影响;Transwell实验和Matrigel实验检测PRNCR1低表达对结直肠癌侵袭转移的影响。构建裸鼠皮下荷瘤模型，体内实验评估PRNCR1的功能。ROC曲线分析PRNCR1在结直肠癌中的诊断价值。生存曲线评估PRNCR1表达情况对肠癌患者生存的影响。　　结果: PRNCR1在CRC肿瘤组织中高表达（平均上调10.5倍），并与结直肠癌大小显著相关(p=0.006)。ROC曲线分析提示PRNCR1还可能有效的诊断结直肠癌(PRNCR1:0.799比CEA/CA19-9:0.651)。PRNCR1高表达的患者5年生存率显著低于低表达患者。CCK8实验结果显示:沉默PRNCR1表达后，24、48、72、96h实验组450mm吸光度值较对照组显著降低(p＜0.05)。同时细胞被阻滞在G0-G1期，S期分布减少;裸鼠皮下荷瘤模型提示PRNCR1促进肿瘤生长。　　结论: PRNCR1是结直肠癌的特异性长链非编码RNA，能促进结直肠癌的增殖，是潜在的诊断性标志物，其高表达可能会导致不良预后。　　第三部分 lncRNA PRNCR1促进结直肠癌增殖的机制研究　　背景: 新近研究表明结直肠癌相关的lncRNA可通过各种方法参与多种生物过程，包括表观遗传调节，转录调节等。PRNCR1首先被发现于去势抵抗型前列腺癌中。而在结直肠癌中，PRNCR1异常表达同样会增加肿瘤的易感性。事实上PRNCR1启动的信号传导通路远比预期的功能更强大，如LSD1等。在本研究中我们将着重探讨其促进肠癌增殖的机制。　　方法: 细胞核细胞质分离检测PRNCR1的亚细胞定位。Western blot检测干扰PRNCR1后HOXA5表达水平。RBP结合能力预测LSD1可能性大，RNA免疫共沉淀实验（RNA immunoprecipitation，RIP）评估PRNCR1与LSD1结合能力。染色质免疫共沉淀（Chromatin immunopercipitation，CHIP）实验检测LSD1是否可与HOXA5启动子区组蛋白结合。同时行拯救实验、CCK8实验和克隆形成实验验证PRNCR1、HOXA5相互关系及其结直肠癌增殖中的调控作用。　　结果: PRNCR1表达主要定位在细胞核中，并可招募LSD1。参照人肿瘤抑制基因数据库，对干扰PRNCR1后的转录本进行测序，所得到的上调基因和抑癌基因库取交集，筛选出7个PRNCR1下游靶基因，再行qRT-PCR检测发现HOXA5被抑制最明显。RIP和CHIP实验表明PRNCR1通过绑定结合并招募LSD1复合物介导HOXA5启动子区域的H3K4me2去甲基化，从而抑制抑癌基因HOXA5表达。另外，实验证实PRNCR1与抑癌基因HOXA5表达水平呈现负相关，可促进结直肠癌增殖。　　结论: PRNCR1可通过招募LSD1表遗传抑制HOXA5表达而促进肠癌细胞增殖，可能是结直肠癌的新靶标。