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第一部分OCT4靶向miRNA的系统性筛选目的：从目前己知的人类miRNA中筛选出能特定靶向结合到OCT43’UTR端，并能引起OCT4表达下调的miRNA a方法：应用＿多种生物信息学软件预测OCT43’UTR的靶向miRNA,．然后通过构建OCT4-3’UTR荧光素酶报告基因系统质粒，同预测的miRNA共转染检测相对荧光素酶活性；随后将筛选出的miRNA转染膀肤癌细胞系内，选择出能下调OCT4表达的miRNA;构建OCT43’UTR突变体荧光素酶报告基因系统质粒，同相应的miRNA共转染后检测相对荧光素酶活性，得到通过结合OCT43’UTR下调OCT4表达的miRNA结果：应用软件TargetScan预测结果有7-8个碱基可配对结合，4个miRNA结合强度为conserved,50个miRNA结合强度为poorly conserved; miRDB以默认参数对结合能力评分排序，得到7个miRNA; miRanda以默认参数预测评分，得到11个miRNA; miRWalk与Pictar软件未得出有意义的结果。合并后预测出61个miRNA与OCT4的3’ UTR有结合能力；其中有1个(1.6%) miRNA同时为3个软件所预测，9个（14.8%）miRNA同时为2个软件所预测，51个（83.6%）仅为1个软件所预测。构建双荧光素酶报告系统，验证出20个miRNA改变了其表达的荧光素酶相对活性；通过在膀肤癌细胞系中转染mimics后的Western blot检测，结合8个miRNA与构建的突变体验证结果，最终3个miRNA被确认通过完整的筛选流程。结论：应用靶向OCT4的miRNA筛选流程：首先多个生物信息学预测软件预测，随后荧光素酶报告系统验证，检测转染细胞后OCT4基因的表达，最后构建突变体验证，能高效迅速地筛选出靶向OCT4的rniRNA,有较好的效价比易于在实验室应用开展。第二部分miRNA靶向OCT4抑制膀肤癌细胞系活性与增殖目的：研究膀肤癌组织和细胞中的OCT4表达同临床病理的联系；研究膀肤癌细胞系转染miRNA后生物学行为的改变，在细胞水平验证miRNA具体功能并探讨其发生的机制方法：应用免疫组化和实时定量PCR,检测膀肤癌组织中OCT4的表达；将筛选出靶向结合OCT43`UTR的miRNA分别转染膀肤癌细胞系，观察其靶基因OCT4的表达情况，观察膀肤癌细胞系5637和HT-1376细胞活性MTS吸光值变化及集落形成能力的改变。结果：检测的31例膀肤癌石蜡标本组织中有83.9%有表达，16对膀肤癌与癌旁组织中膀肤癌组织OCT4平均表达高于正常组织64倍。分别转染miR-335,miR-4654,miR-3657后，5637和HT1376细胞中的OCT4表达下调；MTS细胞活性检测结果表明转染miR-335, miR-4654, miR-3657后的5637细胞72小时相对吸光值A492分别为1.20±0.04,1.10±0.03,0.96±0.03,与NC对照组1.4310.05相比差异有统计学意义；转染miR-335, miR-4654, rniR-3657后的HT-1376细胞72小时相对吸光值A492分别为0.85±0.02,0.71±0.02,0.62±0.03,与NC对照组1.3010.03相比差异有统计学意义；集落形成实验显示，转染miR-335、miR-4654, miR-3657后的5637细胞按每孔1000种板培养10天后集落形成的数量分别为361.8±45.16,262.3133.12、412.5±35.71，同对照组NC540.3±32.48相比差异有统计学意义；转染miR-335, miR-4654, miR-3657后的HT1376细胞按每孔500种板培养14天后集落形成的数量分别为209.5±31.78,171.3±19.76,206.3±14.51，同对照组NC的304.8±16.57相比差异有统计学意义。结论：miR-335、miR-4654, miR-3657能通过靶向OCT4抑制膀肌癌细胞系5637和HT-1376的细胞活性，抑制其增殖。第三部分miR-335靶向OCT4调控ACHN肾癌肿瘤干细胞生物学行为目的：研究miR-335在细胞水平靶向OCT4并调控ACHN肾癌肿瘤干细胞的生物学行为方法：以CD105为标记物在肾癌细胞系中筛选、培养并鉴定出CD105+ACHN肿瘤干细胞，利用慢病毒载体稳定转染miR-335并建立细胞株。检测细胞株的OCT4的表达，观察miR-335影响ACHN CD105十肿瘤干细胞的成球能力、细胞周期的改变，以及细胞形态及划痕实验中细胞迁移能力的变化。结果：以CD105+为标记成功筛选建立肾癌肿瘤干细胞株，检测其干细胞表面标志物：Sox-2／c-Myc／Nanog／OCT4/CD44／nestin／Pax2／DLK／CXCR4/Musashi均呈现高表达，24小时和48小时顺铂处理的ACHN CD105+细胞其增殖活性明显高于ACHN CD105一细胞；细胞周期检测ACHN CD105+相对于ACHN CD105一细胞GO期明显延长（6.3%vs2.27%）。MiR-335稳定转染后ACHN CD105+肿瘤干细胞OCT4表达减低，部分干细胞特性随之减弱或消失，miR-335稳转肿瘤干细胞株的成球能力下降，每1000细胞成球数量同ACHN CD105+细胞成球数量差别有统计学意义，细胞周期GO期缩短(2.9%vs6.3%)，细胞形态变化细胞突起和伪足减少，划痕实验中稳转miR335后ACHN CD105+细胞24h,48h;72h,80h的细胞迁移能力明显下降。结论：应用CD105作为肾癌肿瘤干细胞分选标准，能分选出具备有干细胞特性的ACHN肾癌肿瘤干细胞。ACHN CD105+肾癌肿瘤细胞具备肿瘤干细胞特性。miR，335能在细胞水平下调肿瘤干细胞的OCT4的表达，调控肾癌ACHN细胞系肿瘤干细胞周期，并导致肿瘤干细胞的分化和细胞迁移能力下降。