第一部分:低剂量地西他滨通过调控LKB1恢复ITP髓系抑制细胞的免疫调节功能研究背景:原发免疫性血小板减少症（Primary immune thrombocytopenia,ITP）是一种自身免疫性出血性疾病,其特点是血小板数量减少和出血风险升高,包括皮肤粘膜出血、月经过多、内脏出血甚至颅内出血等,严重威胁人类健康。ITP发病机制尚未完全阐明,随着不断探索发现ITP免疫失衡,包括免疫效应细胞（如细胞毒性T细胞）过度活化和免疫调节细胞（如调节性T细胞）功能异常;先天免疫细胞失衡,如M1/M2巨噬细胞极化异常、Fcγ受体表达失衡、MDSCs功能缺陷等,均在发病中至关重要。髓系抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）是一种起源于髓系祖细胞的异质性未成熟细胞。MDSCs的主要功能特点是抑制多种形式的免疫反应,以左旋精氨酸为底物的精氨酸酶1和诱导型一氧化氮合酶在MDSCs对效应T细胞的抑制作用中至关重要,还可促进调节性T细胞募集和扩增,并抑制B细胞增殖和功能,值得注意的是,MDSCs的免疫抑制功能基于正常的脂肪酸氧化。课题组既往研究结果表明ITP患者存在MDSCs数量及功能异常,MDSCs转输进行细胞治疗可有效改善主动型慢性ITP模型小鼠的生存率和血小板计数。地西他滨是一种DNA甲基化转移酶抑制剂,既往用于治疗骨髓增生异常综合征和移植后血小板减少症中有良好的提高血小板的作用。课题组已证实:低剂量地西他滨在治疗难治性ITP中具有较好的安全性,约半数患者获得过缓解,约1/3可达1年以上的长期缓解。同时,课题组研究发现地西他滨可通过抑制转录激活蛋白3信号转导、活化以增强Treg细胞在ITP中的免疫抑制功能,并限制细胞毒性T淋巴细胞对血小板的细胞毒性。然而,地西他滨是否可以通过调节固有免疫细胞来改善ITP的免疫失衡仍然未知。肝脏激酶B1（liver kinase B1,LKB1）是一种是由抑癌基因STK11/LKB1编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,对细胞的生长、极性以及能量代谢具有重要的调控作用。AMPK（AMP-activated protein kinase）是 LKB1 下游的“能量感应”分子,能够在低能刺激下促进糖和脂肪酸的摄取、氧化并启动细胞分解代谢。LKB1信号通路在免疫细胞的代谢平衡与功能稳态之间扮演重要的“桥梁”角色,是参与抑制活性、免疫稳态和调节的最佳编程。研究目的:（1）探究低剂量地西他滨对ITP患者MDSCs数量和功能的影响,并通过临床标本明确LKB1在MDSCs代谢及免疫功能稳态调控中的作用。（2）应用ShRNA转染技术体外干预及主动型ITP小鼠模型体内验证,探究LKBI对MDSCs代谢及功能的稳态调控作用,对ITP的致病机制作出新的解释。研究方法:（1）ITP患者及健康志愿者:采集年龄、性别匹配的ITP患者和健康者的外周血,采集药物治疗前后的外周血。（2）构建主动型ITP小鼠模型:将野生型C57BL/6小鼠的血小板尾静脉注射给同背景CD61基因敲除（knockout,KO）小鼠免疫CD61 KO小鼠,将免疫成功后CD61KO小鼠的脾细胞腹腔注射给重度联合免疫缺陷小鼠（severe combined immunodeficient,SCID）小鼠。（3）体外细胞培养:获得健康对照和ITP患者的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。加入细胞因子 rhIL-6,rhGM-CSF体外培养7天,并加入不同处理（PBS、Dec、NC shRNA、LKB1 shRNA、NC shRNA+Dec、LKB1 shRNA+Dec）。（4）流式细胞术检测:检测ITP患者和健康对照组,以及ITP治疗前、后:MDSCs的比例,MDSCs胞内LKB1,Arg-1和iNOS的表达。（5）MDSCs代谢功能:检测体外培养的不同处理的ITP患者和健康对照的MDSCs,LKB1 shRNA转染的MDSCs以及小鼠骨髓MDSCs的细胞耗氧率（oxygen consumption rate,OCR）。（6）MDSCs ATP生成:获得ITP患者体外不同处理的MDSCs,不同治疗组的ITP小鼠骨髓MDSCs,测定细胞内ATP生成水平。（7）MDSCs抑制功能实验:将CFSE染色的CD4+CD25-Teffs与PBS、地西他滨、NC shRNA、NC shRNA+Dec、LKB1 shRNA、LKB1 shRNA+Dec 处理后的MDSCs细胞共培养,流式细胞术检测效应T细胞增殖。（8）MDSCs抑制CTL的杀伤作用的检测:将ITP患者体外诱导的MDSCs细胞（PBS、Dec）与CD8+T细胞共培养,再将不同处理的CTL细胞与血小板共同孵育,检测CTLs诱导的血小板凋亡情况。（9）实时定量PCR（Quantitative real-time PCR）:收集ITP患者体外培养的MDSCs或ITP小鼠骨髓MDSCs,检测MDSCs抑制性细胞因子,LKB1-AMPK信号通路,以及线粒体DNA的转录水平。（10）蛋白免疫印记（Western blot）:收集体外培养的健康对照和ITP患者,及ITP治疗前后的MDSCs,检测LKB1蛋白水平的改变。（11）shRNA转染:应用ShRNA技术构建靶向沉默LKBI的慢病毒干扰载体,稳定转染ITP患者MDSCs,分析MDSCs的功能。（12）免疫荧光:制作股骨石蜡切片,标记抗小鼠Ly-6C/G及LKBI,荧光共聚焦显微镜下观察并量化骨髓中MDSCs的数目及MDSCs内LKB1表达水平。（13）Massarray DNA甲基化定量检测:检测地西他滨治疗前后MDSCs中LKB1基因启动子区甲基化水平。（14）体外诱导小鼠MDSCs:从C57BL/6背景野生型小鼠的骨髓获得MDSCs,加入细胞因子培养,并给予PBS、地西他滨、NC shRNA、NC shRNA+Dec、LKB1 shRNA、LKB1 shRNA+Dec 处理。（15）主动ITP小鼠模型的细胞治疗:在主动ITP小鼠模型造模的同时给予上述不同药物和慢病毒处理过的MDSCs腹腔注射进行细胞治疗,35天后,检测骨髓MDSCs的代谢水平,OXPHOS相关基因表达及细胞因子分泌。（16）细胞因子检测:酶联免疫标记法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测主动模型小鼠血清的IL-10、IL-4、TGF-β和VEGF表达水平。研究结果:（1）低剂量地西他滨体内扩增MDSCs比例,纠正其功能。ITP患者CD11b+CD33+HLA-DRlow（MDSCs）的比例显著低于健康对照组,且外周血MDSCs功能分子Arg-1明显低于正常人,iNOS的表达显著高于正常人。地西他滨治疗后,MDSC比例增高,Arg-1表达升高,iNOS表达降低。（2）低剂量地西他滨增强ITP患者MDSCs的有氧代谢。体外研究中,不同浓度梯度结果显示低剂量地西他滨（50和100 nmol/L）显著扩增体外诱导的MDSCs。诱导过程中加入PBS或地西他滨处理,发现难治复发性ITP中的MDSCs氧化磷酸化能力缺陷,线粒体电子传递链活性降低,可通过地西他滨予以纠正。地西他滨治疗后,细胞内ATP水平显著升高。（3）低剂量地西他滨增强MDSCs免疫抑制功能。将体外诱导的MDSCs,与CFSE标记的CD4+CD25Teff细胞共培养评估MDSCs免疫抑制作用,发现ITP患者的MDSCs抑制Teff细胞增殖的能力显著低于健康对照,低剂量地西他滨显著增强了 ITP患者MDSCs的免疫抑制功能。将体外诱导的MDSCs与CTLs共培养后,发现与地西他滨处理的MDSCs共培养后,CTLs诱导的血小板凋亡被显著抑制,解释了地西他滨处理的MDSCs对CTLs的细胞毒性有抑制作用。（4）低剂量地西他滨处理的MDSCs细胞治疗改善了主动ITP小鼠的血小板减少。我们通过建立慢性主动型ITP小鼠进行体内实验。从野生小鼠骨髓中分离出MDSCs,分别用PBS和地西他滨处理。在造模同时将不同处理后的MDSCs过继性转输给主动ITP小鼠进行细胞治疗。地西他滨处理的MDSCs治疗组的血小板水平在28天、35天显著高于另外两组。地西他滨处理的MDSCs治疗组氧化磷酸化水平显著增高,同时细胞内ATP水平升高。此外,我们发现对照组的MDSCs 中 FAO/OXPHOS相关基因 ACADM、HADHA 和 PGC1β mRNA 表达水平明显低于地西他滨处理的MDSCs治疗组。另外,地西他滨处理的MDSCs治疗组血清中IL-4、TGF-β、IL-10明显升高。（5）低剂量地西他滨可上调MDSCs中LKB1信号通路下游调控因子和抑制性细胞因子的表达。通过western和流式细胞术检测发现LKB1表达水平低于健康对照组,地西他滨治疗后LKB1表达水平明显升高。ITP患者LKB1信号通路调控因子:LKB1、AMPKα1、AMPKα2、AMPKβ1、AMPKβ2、AMPKγ1、AMPKy2,线粒体 DNA:ND-1、ND-3和ATP-6及抑制性细胞因子:IL-10,VEGF,和TGFβ的mRNA表达明显低于健康对照组,地西他滨治疗可纠正。对地西他滨治疗前后ITP患者MDSCs中LKB1启动子区甲基化进行分析发现部分CpG发生去甲基化。（6）LKB1 shRNA干扰抵消地西他滨体外诱导MDSCs代谢活性的改变。用LKB1 shRNA转染成功沉默ITP患者MDSCs中的LKB1,RT-PCR检测转染效率,LKB1基因敲除率≥69.26%。为明确地西他滨治疗的作用途径,将成功转染LKB1 shRNA的MDSCs分别给予PBS和地西他滨治疗。研究发现相对于NC shRNA组,LKBI基因敲除显著降低了 MDSCs氧化磷酸化水平,且未能被地西他滨处理纠正。LKB1 shRNA组细胞内ATP水平明显低于NC shRNA组,同样地西他滨处理未能纠正。（7）LKB1 shRNA干扰抵消地西他滨对MDSCs的体外抑制功能的增强作用。用LKB1 shRNA转染成功沉默ITP患者MDSCs中的LKB1,LKB1 shRNA转染的MDSCs治疗组对CFSE标记的CD4+CD25-Teff细胞增殖的抑制显著低于NC shRNA治疗组,表明MDSCs的抑制功能是依赖于LKB1分子的表达水平。LKB1 shRNA+地西他滨组的抑制功能与LKB1 shRNA无显著差异,沉默LKB1抵消了在早期试验中观察到的地西他滨诱导的MDSCs抑制功能增强,而这种增强在NC shRNA+地西他滨组中持续存在。（8）LKB1 shRNA干扰部分抵消地西他滨处理的MDSCs对ITP小鼠模型的治疗效果。构建主动模型,给予空白（第1组）,NC shRNA+PBS（第2组）,NC shRNA+地西他滨（第3组）,LKB1 shRNA+PBS（第4组）,LKB1 shRNA+地西他滨（第5组）处理的MDSCs过继性转输给主动ITP小鼠。第28天、35天,LKB1 shRNA组血小板未见明显升高,同样LKB1 shRNA+地西他滨组并未明显改善ITP小鼠的血小板减少,提示下调LKB1后地西他滨处理的MDSCs丧失治疗作用。免疫荧光显示第3组的LKB1表达显著高于第2组,表明地西他滨显著改善血小板计数并增加MDSCs LKB1表达,在第4组和第5组中LKB1的表达显著低于第二组,呈现出了较低的血小板计数。LKB1 shRNA处理的MDSCs组氧化磷酸化水平显著低于NC shRNA组。氧化磷酸化相关基因的mRNA表达第4组的ACADM和PGC1β mRNA表达显著低于第2组,且与第5组之间无统计学差异。研究结论:（1）ITP患者PBMCs中MDSCs的数量及功能异常,低剂量地西他滨治疗后可改善。（2）MDSCs中LKB1低表达导致的代谢功能和免疫抑制功能受损参与了免疫性血小板减少症的发病机制,可能是ITP患者复发和难治性的原因之一。（3）低剂量地西他滨通过纠正MDSCs中LKB1异常表达,改善ITP患者MDSCs的有氧代谢和免疫抑制功能。第二部分:雷帕霉素通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制ITP中CTLs诱导的血小板凋亡研究背景:原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia,ITP）是主要临床表现为皮肤黏膜出血、内脏出血、患者甚至颅内出血的免疫性出血性疾病。ITP发病机制复杂,以靶向血小板表面蛋白的自身抗体为特征,最常见的是GPⅡbⅢa（Ⅱb 3整合素）,导致血小板破坏。除自身抗体外,众多研究探索了其他血小板破坏机制,其中最重要的是CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的血小板破坏。已发现血小板特异性CTL在活动性ITP患者中升高。此外,在体外已显示CTL介导的自体血小板细胞毒性,颗粒酶和穿孔素是细胞介导毒性的重要功能蛋白,来自ITP患者的CTL可导致直接的血小板凋亡或溶解,是ITP患者血小板破坏的重要机制。磷酯酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）、蛋白激酶 B（Protein kinase B,Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）构成了 PI3K/Akt/mTOR信号级联反应,Akt是磷酸肌醇3-直接的下游效应子激酶（PI3K）。PI3K/Akt/mTOR在多种自身免疫性疾病有基因水平、蛋白表达和激酶活性的异常变化,与T细胞的异常分化和活化密切相关。既往研究表明MTORC1调节Th1和Th17亚群的分化,而Th2亚群依赖于mTORC2调控,抑制mTOR活性可促进调节性T细胞的生成。PI3K/Akt/mTOR参与CD8+T细胞的分化和激活,越来越多的证据表明激活PI3K/Akt/mTOR信号通路分子可促进CD8+T细胞向CTLs分化,发挥免疫调节作用,提示PI3K/Akt/mTOR在ITP发病机制中的重要作用。雷帕霉素-mTORC1分子抑制剂,在自身免疫性疾病、肿瘤、糖尿病等疾病中发挥免疫调节作用。一项临床研究表明,雷帕霉素联合小剂量强的松在ITP中临床反应更快、持续疗效好、安全性无明显影响、无严重感染等副作用。然而,雷帕霉素内源性机制仍有待探索,我们猜测ITP患者PI3K/Akt/mTOR信号通路相关分子存在活化异常,可能与ITP患者CD8+T细胞分化产生CTLs进而造成血小板破环增多密切相关。深入研究ITP中PI3K/Akt/mTOR信号通路对CD8+T细胞分化生成CTLs的调控作用并探索新的干预靶点对于进一步丰富ITP的发病机制及发展新的治疗策略意义重大。研究目的:（1）探究研究PI3K/Akt/mTOR信号通路相关分子在ITP患者CD8+T细胞中的表达及活化水平。（2）探究雷帕霉素对PI3K/Akt/mTOR信号通路表达的调控作用,阐明雷帕霉素对CTLs破坏血小板的抑制作用。研究方法:（1）ITP患者及对照:采集年龄、性别匹配的两组外周血,所有ITP患者均符合诊断标准。（2）体外细胞培养:磁珠分选CD8+T细胞,加入细胞因子rhIL-2、CD3、CD28体外培养,分别加入DMSO和雷帕霉素培养72小时。（3）流式细胞术检测:检测CD8+T细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化水平,检测CD8+T细胞亚群的比例。（4）CD8+T细胞毒性细胞因子分泌:流式细胞术检测ITP和健康对照,雷帕霉素（20 nmol/L）处理后穿孔素、颗粒酶B的分泌。（5）CTLs诱导的血小板凋亡检测:CTL加入雷帕霉素共培养,将105的CD8+T细胞与106血小板混合孵育,体外培养4小时,检测血小板调亡。（6）蛋白免疫印记（Western blot）:检测雷帕霉素培养后,PI3K/Akt/mTOR信号分子的表达及活化水平。（7）构建主动ITP小鼠模型:将野生型C57BL/6小鼠的血小板,尾静脉注射给同种CD61 KO小鼠,将成功免疫后CD61KO小鼠的脾细胞腹腔注射给射线照射后的SCID小鼠。研究结果:（1）ITP患者CD8+T细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路异常活化。流式细胞术检测PI3K/Akt/m TOR信号分子的活化水平,发现ITP患者Akt、mTOR、4E-BP1、P70S6K 分子的磷酸化水平（p-Akt、p-mTOR、p-4E-BP1、p-P70S6K）显著高于健康对照。（2）ITP患者CD8+T细胞部分亚群失衡。ITP患者CD8+T细胞亚群部分失衡,其中naive T细胞亚群显著低于正常对照,效应记忆T细胞亚群显著高于正常对照,而终末效应T细胞亚群和中央记忆T细胞亚群较正常对照组无显著统计学差异。CD8+CD28-抑制性T细胞亚群无统计学差异。（3）ITP患者CD8+T细胞毒性分子表达增高。我们检测发现ITP患者中CD8+T细胞内细胞毒性相关分子穿孔素、颗粒霉素B的释放水平均显著高于对照。（4）雷帕霉素显著抑制CD8+T细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路的异常活化。通过流式细胞术和Western blot分析发现,雷帕霉素处理后mTOR、Akt、4E-BP1、P70S6K的表达水平无显著差别,但是p-mTOR、p-Akt、p-4E-BP1、p-P70S6K的磷酸化水平经雷帕霉素处理后被显著抑制。同样,p-mTOR/mTOR,p-AKT/AKT,p-4E-BP1/4E-BP1,p-P70S6K/P70S6K 的比值也显著下调。（5）mTOR抑制剂雷帕霉素部分纠正ITP患者中的CD8+T细胞亚群失衡。将ITP患者外周血的CD8+T细胞加入雷帕霉素体外培养后,发现雷帕霉素部分纠正了 CD8+T细胞的亚群失衡,其中na?ve T细胞亚群（CD45RA+CD97+）表达增高,中央记忆T细胞亚群（CD45RA-CD97+）、效应记忆T细胞亚群（CD45RA-CD97-）表达降低,终末效应T细胞亚群（CD45RA+CD97-）雷帕霉素处理后无显著差异。（6）mTOR抑制剂雷帕霉素纠正ITP患者CD8+T细胞毒性相关分子的表达。将ITP患者外周血的CD8+T细胞加入雷帕霉素体外培养后,发现雷帕霉素处理后ITP患者CD8+T细胞内毒性相关分子穿孔素、颗粒霉素B的表达水平显著降低。（7）mTOR抑制剂雷帕霉素抑制ITP患者CTLs对血小板的杀伤。通过体外实验,分选ITP患者外周血中的CD8+T细胞,加入雷帕霉素体外培养。设置不同分组:血小板、血小板+CTLs、血小板+雷帕霉素、血小板+CTLs+雷帕霉素,检测血小板凋亡水平。结果显示,雷帕霉素处理显著抑制CTLs介导的血小板凋亡。（8）mTOR抑制剂雷帕霉素通过抑制主动ITP小鼠CD8+T细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路表达改善血小板减少。我们构建了主动型ITP小鼠模型通过体内实验进一步验证雷帕霉素的效果。在第28天和35天,与对照组相比,雷帕霉素组ITP小鼠血小板计数显著升高。雷帕霉素治疗组ITP小鼠脾脏CD8+T细胞毒性分子穿孔素、颗粒霉素B的表达显著低于对照组。我们进检测了 ITP小鼠脾脏和胸腺中PI3K/Akt/m TOR信号通路分子的表达,发现在雷帕霉素治疗组的ITP小鼠的胸腺,脾脏的CD8+T细胞上p-mTOR、p-Akt、p-4E-BP1、p-P70S6K的磷酸化水平显著低于对照组。研究结论:（1）ITP患者CD8+T细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路相关分子存在异常活化,且CD8+T细胞亚群失衡。（2）雷帕霉素可抑制PI3K/Akt/mTOR信号分子的异常活化,在一定程度上恢复亚群的失衡,减少毒性细胞分子的分泌。（3）雷帕霉素通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制CTLs介导的血小板凋亡,恢复ITP患者免疫失衡。