背景神经病理性疼痛(neuropathic pain)可继发于中枢或外周神经系统任何部位的损伤或疾病,特征性表现为自发性疼痛(spontaneous pain)、痛觉过敏(hyperagesia)及痛觉超敏(allodynia)。目前针对神经性疼痛的一些研究集中在DRG神经元的瞬时感受器电位离子通道家族(Transient receptor potential channel, TRP channel)及其功能上。背根神经节是许多伤害性刺激传入的通道,与疼痛相关的许多受体、离子通道以及信号转导分子都存在于DRG。炎性介质如PGE2.5-HT、肾上腺素和神经生长因子(NGF),在初级传入神经元中通过激活细胞内的第二信使环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)-依赖性的蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和环磷鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)-依赖性的蛋白激酶G (protein kinase G, PKG),介导CCD大鼠的痛觉过敏。瞬时感受器电位离子通道家族中香草素受体亚家族TRPV4是近年来研究较多的TRPV家族成员之一,它广泛分布于背根神经节、肾远曲小管的上皮组织、心、肝、肺、脾以及许多其它组织。TRPV4是一种多觉感受器,可以被低渗、机械刺激、热、佛波醇酯、低pH值、柠檬酸盐、anandamide (AEA)和其代谢产物花生四烯酸(arachidonic acid, AA)、以及bisandrographolide A (BAA)等激活。TRPV4基因敲除的小鼠表现出对炎症引起的热痛觉过敏降低以及对伤害性压力刺激的回避反应降低,但对非伤害性热和触觉刺激的反应正常。一氧化氮(nitric oxide, NO)是细胞内重要的信使分子和神经递质,它对炎性疼痛的发展和维持起到了重要作用。动物实验研究证明,使用NO或cGMP合成酶抑制剂能够减轻炎性痛和神经病理性疼痛。NF-κB是基因转录的调控因子,当受到细胞因子、氧化应急、一些化学和疼痛性伤害时,NF-κB被激活,参与众多基因的诱导表达。研究者发现,在脊髓和背根神经节中NF-κB参与伤害性感觉信息的传递。我们前期的研究发现,TRPV4-NO-cGMP-PKG信号通路在CCD大鼠痛觉过敏中发挥重要的作用,NF-κB参与介导了TRPV4-NO信号通路。然而,到目前为止,在CCD大鼠痛觉过敏中TRPV4与NO之间,TRPV4与NF-κB之间的具体的机制尚不清楚。TRPV4是非选择性阳离子通道,对钙离子具有较高的通透性,细胞内外钙离子浓度可以调节TRPV4的功能。钙离子通道通过调节钙离子内流,在神经系统的很多过程中都发挥重要的作用,如递质在突触部位的释放、神经元兴奋性的调节以及突触可塑性和基因转录等。胞内钙离子浓度的升高胞内Ca2+浓度增高活化腺苷环化酶(AC),使cAMP合成增加,由此可以激活cAMP依赖性的PKA。研究发现,在皮肤上皮细胞,钙离子通透性的TRPV4通道是在将UVB刺激转化为细胞内信号并将该信号传递到感觉神经元从而使皮肤产生疼痛的过程中发挥关键作用,目前,已经确定有五种类型的钙离子通道：L型、T型、N型、P/Q型和R型,他们各自具有独特的电生理学和药理学特性。T型钙通道是在背根神经节的外周感觉神经元中首次被发现的,它具有快速激活、缓慢关闭和在静息电位下即可激活的特点,可直接或间接的影响多种生理过程如激发神经动作电位形成、增加突触兴奋性和促进神经递质释放等,对调节神经元的兴奋性加剧疼痛进展,发挥重要作用。神经系统T型钙通道广泛分布于外周感觉初级神经元、背根神经节、脊髓背角和脑内神经组织等部位,根据其编码基因不同分为a1G(CavT.1), a1H (CavT.2)和a1I(CavT.3)三种亚型。T型钙通道通过调节钙离子内流,与神经兴奋性动作电位形成、神经递质释放以及钙依赖相关基因的表达有关。在糖尿病性神经痛和CCI动物模型中,T型钙离子通道的密度显著增加。因此,我们推测TRPV4依赖性的钙离子浓度变化可能介导了CCD大鼠痛觉过敏中TRPV4-NO的信号通路。目的研究TRPV4依赖性的Ca2+在CCD大鼠痛觉过敏TRPV4-NO信号通路中的作用。方法1.大鼠蛛网膜下腔置管(鞘内置管)及CCD模型的制备将大鼠随机分为CCD组和假手术组。大鼠先用戊巴比妥钠(50 mg/kg,腹腔注射)麻醉后,沿L4-S1棘突作后正中偏右切口,显示L4与S1棘突间隙,将PE-10聚乙烯导管插入蛛网膜下腔并固定,生理盐水填满并加热封闭末端。暴露右侧L4及L5椎间外孔,将“U”形棒的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,另一端位于椎管壁外。使之挤压大鼠L4、L5的背根神经节。术后局部生理盐水冲洗,间断缝合肌肉、腰背筋膜、皮下组织以及皮肤。用金属保护罩保护导管远端。腹腔注射青霉素预防感染。术毕将大鼠放入鼠笼,于温暖、安静环境自由喂养。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组。手术由同一人操作以保证一致性。术后大鼠没有发生自残现象,也没有表现出感觉完全缺失2. TRPV4 siRNA对痛觉敏感的影响为了测量TRPV4 siRNA对痛觉敏感的影响,大鼠被随机分为假手术组(sham)和CCD组。每个组又分为对照组、TRPV4慢病毒干扰组(CCD+LV-TRPV4)和TRPV4’慢病毒阴性对照组(CCD+LV-NC)三个亚组。假手术组中未接受任何处理的大鼠作为对照,CCD组中只接受CCD手术的大鼠作为对照。TRPV4 siRNA通过鞘内置管注射,注射时间不少于10min, 10μl/d,每天一次,共3天。3.钙通道阻断剂对痛觉敏感的影响为了测量钙通道阻断剂(mibefradil)对痛觉敏感的影响,大鼠被随机分为假手术组(sham)、mibefradil处理组、生理盐水处理组。其中,mibefradil处理组又分为mibefradil (20mg/kg)组、mibefradil (10mg/kg)组、mibefradil (5mg/kg)三个亚组。Mibefradil溶于0.9%的生理盐水中,总体积为0.1 ml/kg。4.神经行为学测定对大鼠的手术同侧后肢进行行为学检测,TRPV4 siRNA对行为学影响的检测时间为：CCD手术前,CCD手术后第4、7、14、21天；腹腔注射钙通道阻断剂(mibefradil)对行为学影响的检测时间为：药物处理前测量,排除痛觉表现不明显者(<5%)；药物处理后15、30、45、60min分别测量。所有的测量均使用单盲法。(1).运动功能(motor function)观察CCD大鼠自然状态下随意行走的步态,采用记分制。计分方法为：1分=正常步态、足无畸形；2分=正常步态伴明显足畸形；3分=轻度步态障碍伴足下垂；4分=严重步态障碍伴肌无力。(2).热辐射刺激缩爪反应潜伏期((Thermal paw withdrawal latency, PWL):选用BME-410C型热痛刺激仪。预先将热痛刺激仪放在有机玻璃板下方,将大鼠放在6mm厚有机玻璃板下方,使光源聚焦照射动物后肢足底掌心,电子秒表记录从照射开始到引起后肢回缩反应时的的时间即为热福射刺激缩爪反应潜伏期的观测指标。取每只大鼠6次测量结果的均值为统计数据。(3).机械刺激缩爪阈值(Mechanical withdrawal threshold, MWT):使用BME-403型Von Frey Fibers机械痛刺激仪。先将大鼠放在铁丝网上,用不同折力的Von Frey纤毛刺激大鼠手术侧足底,如大鼠出现快速缩足或舔足现象为阳性反应。每只大鼠均从小剂量的针丝开始刺激,,每根针丝测量5次,至少能够引发3次缩爪反应的针丝强度即为机械痛阈值。取每只大鼠6次测量结果的均值为统计数据。结果1.TRPV4 siRNA对痛觉敏感的影响与假手术组相比,CCD大鼠手术侧热辐射刺激缩爪反应潜伏期(PWL)和机械刺激缩爪阈值(MWT)明显降低(P<0.05)。术后7天时,机械痛觉和热痛觉阈值降至最低,此后逐渐升高。鞘内注射TRPV4 siRNA 10μl/d,分别测CCD手术后第0、4、7、14、21天热辐射刺激缩爪反应潜伏期(PWL)和机械刺激缩爪阈值(MWT)。结果显示：在CCD组大鼠,与阴性对照组(LV-NC)相比,TRPV4 siRNA (LV-TRPV4)对CCD后大鼠的热痛敏和机械痛敏产生明显抑制作用(P<0.05)；而在假手术组,TRPV4 siRNA并未对大鼠的热痛敏和机械痛敏产生明显的作用(P>0.05)。2.钙通道阻断剂对痛觉敏感的影响腹腔注射不同浓度的钙通道阻断剂mibefradil (20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg),分别测注射后0、15、30、45、60min的热辐射刺激缩爪反应潜伏期(PWL)和机械刺激缩爪阈值(MWT),结果显示：与生理盐水组相比,浓度20mg/kg和10mg/kg的mibefradil可部分抑制CCD后大鼠的机械痛敏和热痛敏(P<0.05),此抑制作用呈剂量依赖性升高。此抑制作用于腹腔注射15min可测得,30min作用达到最大,抑制作用可持续至60min。而5mg/kg mibefradil则没有明显的抑制作用(P>0.05)。3. TRPV4激动剂4a-PDD对钙通道阻断剂的作用腹腔注射钙通道阻断剂mibefradil (20mg/kg),分别测注射后0、15、30、45、60min时的热辐射刺激缩爪反应潜伏期(PWL)和机械刺激缩爪阈值(MWT)。与生理盐水组相比,mibefradil (20mg/kg)对CCD后大鼠热痛觉过敏产生抑制作用(P<0.05)。鞘内注射TRPV4激动剂4a-PDD(100μmol/L)预处理后,能够明显逆转mibefradil (20mg/kg)对CCD后大鼠热痛敏和机械痛敏过敏产生抑制作用(P<0.05)。结论在CCD大鼠的痛觉过敏中,TRPV4依赖性的Ca2+变化参与介导了TRPV4-NO信号通路。背景神经性性疼痛是由神经系统原发性或继发性损害或功能障碍所引起的疼痛。背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)持续受压(chronic compression of DRG, CCD)导致大鼠出现受压侧的自发性疼痛、痛觉过敏和异常疼痛,同时伴随神经元的兴奋性增加,表现为自发性放电增加和电流阈值降低,与临床上腰椎间盘突出症等疾病所导致的症状相似。在初级传入神经元中,炎性介质如PGE2,5-HT、肾上腺素和神经生长因子(NGF),通过激活细胞内的第二信使环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)-依赖性的蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和环磷鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)-依赖性的蛋白激酶G (protein kinase G, PKG),介导CCD大鼠的痛觉过敏。瞬时感受器电位离子通道-香草素亚型4(Transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4)参与DRG神经元介导的疼痛信号传导过程。TRPV4是非选择性阳离子通道,对钙离子具有较高的通透性,细胞内外钙离子浓度可以调节TRPV4的功能。钙离子通道通过调节钙离子内流,在神经系统的很多过程中都发挥重要的作用,如递质在突触部位的释放、神经元兴奋性的调节以及突触可塑性和基因转录等。胞内钙离子浓度的升高胞内Ca2+浓度增高活化腺苷环化酶(AC),使cAMP合成增加,由此可以激活cAMP依赖性的PKA。T型钙通道是唯一的低电压激活钙通道,膜电位去极化至-60 mV即可观察到T型钙电流,可直接或间接的影响多种生理过程如激发神经动作电位形成、增加突触兴奋性和促进神经递质释放等,对调节神经元的兴奋性加剧疼痛进展,发挥重要作用。在糖尿病性神经痛和CCI动物模型中,T型钙离子通道的密度显著增加。目前研究已知,T型钙通道与糖尿病性神经痛、化疗引起的神经痛有密切关系,且选择性敲除鼠CaV3.2基因可以对抗神经性和炎性疼痛。一氧化氮(nitric oxide, NO)是具有生物活性的气体分子,是细胞内重要的第二信使,在神经病理性疼痛及痛觉过敏的发生和持续过程中发挥重大作用。其作用的具体过程是：神经元突触前膜去极化使谷氨酸(Glu)等释放到突触间隙与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)等受体结合,受体通道开放,Ca2+内流与钙调蛋白(CaM)偶联,在还原型辅酶O(NAD2PH)的协助下激活一氧化氮合酶(NOS),催化L-精氨酸(L-Arg),生成NO,激活可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase, sGC),促进环鸟苷酸(cyclic guanoslin monophosphate, cGMP)合成,作用于cGMP门控离子通道,cGMP调节的磷酸二酯酶(PDE), cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)等效应靶分子,参与神经系统伤害性刺激信息传递。动物实验研究证明,使用NO或cGMP合成酶抑制剂能够减轻炎性痛和神经病理性疼痛。NF-κB是基因转录的调控因子,当受到细胞因子、氧化应急、一些化学和疼痛性伤害时,NF-κB被激活,参与众多基因的诱导表达。研究者发现,在脊髓和背根神经节中NF-κB参与伤害性感觉信息的传递。我们前期的研究发现,TRPV4-NO-cGMP-PKG信号通路在CCD大鼠痛觉过敏中发挥重要的作用,而NF-κB参与介导了TRPV4-NO信号通路。然而,到目前为止,在CCD大鼠痛觉过敏中TRPV4与NO之间,TRPV4与NF-κB之间的具体的机制尚不清楚。Ca2+是线粒体NOS(mtNOS)活化的最有效的刺激物。Shirato发现,COS细胞的裂解物中转染了豚鼠iNOS(inducible nitric oxide synthase,诱导型NOS)后,NOS活性显著增加,而阻断钙通道后,NOS的活性下降79%。因此,我们推测TRPV4依赖性的钙离子浓度变化可能参与了CCD大鼠后痛觉过敏的分子机制。目的1.研究TRPV4 siRNA对CCD模型DRG中NF-κB活性和NO含量的影响：2.研究钙通道阻断剂mibefradil dihydrochloride(米拉贝尔)对CCD模型DRG中NF-κB活性和NO含量的影响；3.研究TRPV4依赖性的钙离子变化在CCD后热痛敏TRPV4-NO通路中的作用。方法1.大鼠蛛网膜下腔置管(鞘内置管)及CCD模型的制备将大鼠随机分为CCD组和假手术组。大鼠先用戊巴比妥钠(50 mg/kg,腹腔注射)麻醉后,沿L4-S1棘突作后正中偏右切口,显示L4与S1棘突间隙,将PE-10聚乙烯导管插入蛛网膜下腔并固定,生理盐水填满并加热封闭末端。暴露右侧L4及L5椎间外孔,将“U”形棒的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,另一端位于椎管壁外。使之挤压大鼠L4、L5的背根神经节。术后局部生理盐水冲洗,间断缝合肌肉、腰背筋膜、皮下组织以及皮肤。用金属保护罩保护导管远端。腹腔注射青霉素预防感染。术毕将大鼠放入鼠笼,于温暖、安静环境自由喂养。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组。手术由同一人操作以保证一致性。术后大鼠没有发生自残现象,也没有表现出感觉完全缺失2.鞘内注射TRPV4 siRNA大鼠被随机分为假手术组(sham)和CCD组。每个组又分为对照组、TRPV4慢病毒干扰组(CCD+LV-TRPV4)和TRPV4’慢病毒阴性对照组(CCD+LV-NC)三个亚组。假手术组中未接受任何处理的大鼠作为对照,CCD组中只接受CCD手术的大鼠作为对照。TRPV4 siRNA通过鞘内置管注射,注射时间不少于10min, 10μl/d,每天一次,共3天。3.腹腔注射钙通道阻断剂大鼠被随机分为假手术组(sham)、mibefradil处理组、生理盐水处理组。其中,：mibefradil处理组又分为mibefradil (20mg/kg)组、mibefradil (10mg/kg)组、mibefradil (5mg/kg)三个亚组。Mibefradil溶于0.9%的生理盐水中,总体积为0.1 ml/kg。4.组织免疫荧光将DRG组织进行快速冰冻切片后用4%多聚甲醛室温固定10min,,加入5%BSA室温封闭1h,然后加入GFP一抗(1：400)4℃孵育过夜。PBS冲洗3次后,加入带有绿色荧光标记的GFP二抗室温避光孵育2h。使用DAPI细胞核染色后,封片,激光共聚焦显微镜下观察拍照。5. Western blotting测量TRPV4通道蛋白表达的变化鞘内注射TRPV4-SiRNA后第7天,从各组大鼠手术侧L4-L5DRG中提取蛋白质,经过提取蛋白,凝胶电泳,转膜,标记一抗和二抗,曝光等步骤观察目的蛋白的表达。6.实时定量PCR测量TRPV4 mRNA表达的变化鞘内注射TRPV4-SiRNA后第7天,从各组大鼠手术侧L4-L5 DRG中提取RNA,通过逆转录和RT-PCR的方法检测TRPV4 mRNA表达的变化。7.成年大鼠DRG神经元的培养取出CCD术后第7天手术侧L4-L5的DRG和正常大鼠同侧L4-L5的DRG,Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶分别消化1h和30min后,应用Neurobasal+1%N2+20ng/ml NGF+1%谷氨酰胺+100U/ml青链霉素培养,培养第4天的DRG神经元用于后续实验。8.Ca2+成像实验1mmol/L Fluo-3/AM从-20℃冰箱中取出,室温下复温,应用含有0.02%pluronic F127的等渗溶液将其配制成终浓度5μmol/l。DRG神经元PBS冲洗1次后加入Fluo-3/AM,室温下负载30分钟,负载过程中可轻轻摇晃促进染色,然后PBS冲洗3次。将孵育完的DRG神经元放在LCSM的载物台上,488nm激光激发Fluo-3,观察细胞内Ca2+荧光强度的变化。试验在室温下(<24℃)进行。实验应在室温下(<24℃)进行,且在给予药物刺激之前,应先测量细胞内Ca2+荧光强度至少30秒作为基础值。然后应用4α-PDD(10μmol/l)刺激3分钟,观察施加药物前后荧光强度变化。9. EMSA检测NF-κB活性电泳迁移率改变法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)测定核因子KB结合活性。(1)核蛋白的提取与浓度测定：按照核蛋白提取成套kit操作收获核蛋白。标准BCA法于酶标仪测定蛋白浓度,并置于液氮中保存。(2)Biotin标记探针与纯化：NF-κB结合序列：5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’此为一系列复杂制备过程,包括寡核苷酸合成,Biotin标记,HPLC柱式纯化,NT质谱检测,退火制备双链,探针比活性测定及倍比稀释得到合适的探针工作液浓度用于后续EMSA检测实验；(3)按照EMSA成套试剂的操作手册建立结合反应体系：在消毒离心管中混合10X缓冲液、核蛋白5-10ug、Bio-NF-κB探针,poly (di:dc) (di:dc)和去离子水。将结合反应产物加入上样缓冲液,上样至6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶,以恒电压180 V,于0.5X TBE进行电泳分离。当指示剂溴酚蓝行至凝胶下缘时,终止电泳,移开玻璃块,用3 M的Whatman滤纸揭胶,并0.5X TBE中390MA电转40min,后续经过紫外交联10min,经Blocking, washing等操作加上显色底物并用MPIAS型多媒体图像分析系统进行成像系统扫描。10.亚硝酸盐产物(NO)测量亚硝酸盐水平间接反应DRG内NO产物的含量,按照亚硝酸盐检测试剂盒进行操作。11.统计分析所得数据用means ± SEM表示。根据需要使用two-way repeated measures analysis of variance (RM ANOVA)或者one-way ANOVA,选择Bonferroni t-test, Student-Newman-Keuls Method (SNK)或Tukey Test作为post hoc检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.免疫荧光检测TRPV4 siRNA转染效率鞘内注射表达GFP绿色荧光蛋白的TRPV4siRNA 7天后处死大鼠取出L3-L4 DRGs。图2-1显示,在sham组和CCD组中,鞘注LV-TRPV4组和LV-NC组可以看到明显的绿色荧光。说明TRPV4 siRNA成功转染到DRG神经元内。2. Western blotting示鞘内注射TRPV4 siRNA对大鼠DRG中TRPV4蛋白表达的影响图2-3(A、B)显示,与LV-NC组相比,正常大鼠DRG细胞转染TRPV4 siRNA后TRPV4通道蛋白表达明显降低(n=6.*P<0.05)。图2-3(C、D)显示,与sham组相比,CCD大鼠DRG中TRPV4蛋白表达明显升高,(n=6.*P<0.05)。鞘注TRPV4 siRNA后,与CCD+LV-NC组相比,CCD+TRPV4-LV组大鼠DRG中TRPV4蛋白表达明显降低,(n=6.#P<0.05)；与sham+LV-NC组相比,sham+TRPV4-LV组大鼠DRG中TRPV4蛋白表达明显降低(n=6.& P<0.05)3. RT-PCR示鞘内注射TRPV4 siRNA对大鼠DRG中TRPV4 mRNA表达的影响图2-3(E)显示,与sham组相比,CCD大鼠DRG中TRPV4mRNA表达明显升高, (n=6.*P<0.05)。鞘注TRPV4 siRNA后,与CCD+LV-NC组相比,CCD+TRPV4-LV组大鼠DRG中TRPV4mRNA表达明显降低,(n=6.#P<0.05)；与sham+LV-NC组相比,sham+TRPV4-LV组大鼠DRG中TRPV4mRNA表达明显降低(n=6.& P<0.05)。4.鞘内注射TRPV4 siRNA对DRG神经元TRPV4介导的Ca2+内流的影响图2-4显示,与sham组相比,CCD可引起4α-PDD介导的DRG神经元内Ca2+浓度升高(*P<0.05,n=30),去除细胞外液中的钙以及钌红(RR)可以抑制该反应。与阴性对照组相比,TRPV4siRNA明显抑制CCD后大鼠DRG神经元内Ca2+浓度的升高(#P<0.05,n=30)。5.鞘内注射TRPV4 siRNA对大鼠DRG中NF-κB活性的影响为了测量TRPV4 siRNA对大鼠DRG中NF-κB活性的影响,鞘内注射TRPV4 siRNA 10μl/d,检测7天后大鼠DRG中NF-κB活性,图2-5显示,与sham组相比,CCD后NF-κB活性升高；鞘内注射TRPV4siRNA后,与LV-NC阴性对照组想比,NF-κB活性下降,接近正常水平。6.鞘内注射TRPV4 siRNA对大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度的影响为了检测TRPV4 siRNA对大鼠DRG中NF-κB活性的影响,鞘内注射TRPV4 siRNA 10μl/d,检测7天后大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度,图2-7显示,与sham组相比,CCD后大鼠DRG中NO含量升高(n=6,*P<0.05)；与CCD+LV-NC组相比,CCD+LV-TRPV4组大鼠DRG中NO含量降低(n=6,#P<0.05)。7.腹腔注射钙通道阻断剂mibefradil及TRPV4激动剂4 α-PDD预处理对大鼠DRG中NF-κB活性的影响为了检测钙通道阻断剂mibefradil对大鼠DRG中NF-κB活性的影响,腹腔注射钙通道阻断剂mibefradil (20mg/kg),30min后检测大鼠DRG中NF-κB活性。图2-6显示,与生理盐水处理组相比,腹腔注射mibefradil (20mg/kg)明显降低DRG中NF-κB活性。4a-PDD(100μmol/L)能够逆转mibefradil (20mg/kg)降低DRG中NF-κB活性。8.腹腔注射钙通道阻断剂mibefradil及TRPV4激动剂4 α-PDD预处理对大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度的影响为了检测钙通道阻断剂mibefradil对大鼠DRG中NO含量的影响,腹腔注射钙通道阻断剂mibefradil (20mg/kg),30min后检测大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度。图2-8显示,与生理盐水处理组相比,腹腔注射mibefradil (20mg/kg)明显降低DRG中NO含量(n=6,*P<0.05) 4α-PDD (100μmol/L)能够逆转mibefradil (20mg/kg)降低DRG中NO含量(n=6,#P<0.05)。结论TRPV4激活诱发钙离子内流,介导Ca2+依赖性的一氧化氮合酶(NOS)的产生,NOS进一步介导激活NF-κB从而参与大鼠CCD后痛觉过敏的TRPV4-NO通路