鸡具有易于观察和发育周期短等优点,使其成为了研究肌肉发育的理想的动物模型,产肉也是鸡的主要经济性状之一,因此,对鸡肌肉发育的研究非常重要。长非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)普遍被定义为是一类具有相对较弱或无蛋白编码的潜能、物种间保守性较低、转录本长度大于200nt的RNA分子。相比于mi RNA,lnc RNA的功能机制解析仍然较少。因此,本研究以地方品种固始鸡为研究对象,基于前期6 W固始鸡和AA鸡的胸肌组织转录组测序(RNA-Seq)为基础,从差异表达的15个lnc RNAs基因中筛选出肌肉特异表达的VGLL2-AS,借助生物信息学的分析、利用双向转录和q RT-PCR等生物技术,对肌肉发育相关VGLL2-AS进行鉴定、靶基因的预测及遗传变异研究,并利用RACE技术对靶基因进行了全长克隆。总之,本研究对鸡肌肉发育相关的lnc RNA提供一定的参考意义,并为深入研究天然反义转录本VGLL2-AS的功能机制奠定了基础。1.肌肉特异性表达的VGLL2-AS的筛选鉴定、表达规律及靶基因预测对15个候选的lnc RNAs进行时空组织表达分析,鉴定出一个鸡肌肉发育中特异性表达的lnc RNA,命名为VGLL2-AS。生物信息学分析发现VGLL2-AS位于3号染色体上,包含3个外显子,为VGLL2基因的反义转录本(VGLL2-AS);编码能力预测表明VGLL2-AS为非编码RNA,符合lnc RNA的特征。亚细胞定位预测表明VGLL2-AS定位于细胞质和细胞核中,靶基因预测表明VGLL2-AS通过顺式作用调控靶基因VGLL2。这些结果表明VGLL2-AS属于长链非编码RNA,在鸡发育前期的胸肌组织中特异性高表达。2.VGLL2-AS与VGLL2互作关系分析通过RACE克隆了鸡VGLL2的1895nt全长序列,生物信息学分析发现,鸡VGLL2有4个外显子,包含27个ORFs。对VGLL2氨基酸序列进行同源性比对,发现VGLL2在鸟类、哺乳动物、爬行动物和两栖动物之间序列比较保守。VGLL2-AS与VGLL2具有大片段的重叠区域,通过反向特异引物扩增,发现VGLL2能够双向转录;鸡VGLL2存在可变剪切形式,对其不同转录本验证发现VGLL2基因只存在三种转录本分别为VGLL2-m RNA、VGLL2-X2和VGLL2-X3,且VGLL2-m RNA和VGLL2-X3表达量高于VGLL2-X2;通过对VGLL2-AS与VGLL2各转录本的双链结合能力分析发现,VGLL2-AS与VGLL2各转录本之间能够形成RNA-RNA互补双链。在不同时期的胸肌组织中进行q RT-PCR检测发现VGLL2-AS和VGLL2-m RNA、VGLL2-X3的表达具有显著的正相关(P<0.001)。这些结果表明VGLL2-AS与VGLL2可能具有靶向关系。3.VGLL2-AS基因遗传效应研究利用DNA混池测序的方法筛选出VGLL2-AS基因上两个变异位点,分别为g.1198A>G和g.1238-1239del/ins GA;对序列变异的多样性分析显示VGLL2-AS的变异在分析群体中为低度多态,但隐性白与海兰鸡有较高的群体分化水平。进行VGLL2-AS基因的单倍型与F2代经济性状的相关分析,结果显示VGLL2-AS的A-G突变和GA indel的单倍型与腿肌肌纤维短径、腿肌肌纤维圆度和水分显著相关(P<0.05),与出生重、肌胃重、腿肌肌纤维周长、皮下脂肪厚、碱性磷酸酶和甘油三酯极显着相关(P<0.01);单倍型AGDI在肌肉发育相关的性状中为优势基因型,在选育与肌肉发育相关的性状时可能是一种潜在的分子标记。因此推测,VGLL2-AS基因可能参与了鸡的肌肉发育,然而,VGLL2-AS如何精确调控鸡肌肉发育的机制仍需要进一步探索。4.日粮中添加不同蛋白水平对固始鸡肌肉发育的影响对固始鸡饲喂10%和20%的蛋白水平日粮21 d后,10%蛋白组和20%蛋白组相比,10%蛋白组的平均日增重和末重均显著低于20%蛋白组(P<0.01)。对10%蛋白组和20%蛋白组的胸肌组织HE染色后,结果显示20%蛋白组肌纤维直径极显著大于10%蛋白组(P<0.01)。q RT-PCR分析结果表明,VGLL2-AS、VGLL2-m RNA和VGLL2-X3在10%蛋白组表达上调,且VGLL2-AS和VGLL2-X3差异显著;而Myod与前三者基因相反的表达趋势,在10%蛋白组显著下调。这些结果表明VGLL2-AS、VGLL2-m RNA和VGLL2-X3可能在生长前期促进固始鸡肌肉发育,但分子机制有待深入研究。