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目前世界正面临着严重的能源危机,急需新型环保无污染能源的替代。生物乙醇是一种新型的环保型能源,生物乙醇可以通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵获得。由于酿酒酵母中没有分解高聚合度的果聚糖的酶,因此当用菊粉作为原料时,常将菊粉酶在酿酒酵母中异源表达,分解高聚合度的果聚糖生成果糖,从而提高酿酒酵母的产乙醇能力。目前利用微生物来源的菊粉酶与酵母联合作用产乙醇的报道已经有很多。菊芋(Helianthus tuberosus)的果聚糖外切水解酶(FEHs)也能够将菊粉中的高聚合度的果聚糖分解成低聚合度的果聚糖和果糖,而目前利用植物的果聚糖外切水解酶,在酵母中异源表达并用来协助产乙醇的研究尚未见报道。本研究首次将植物来源的菊芋FEHs酶与表达载体重组,转入酿酒酵母中进行异源表达,并与酿酒酵母协同作用产乙醇,提高了乙醇的产量。此外,菊芋中的果聚糖外切水解酶FEHs目前已有两个基因Ht1-FEH Ⅰ和Ht1-FEH Ⅱ已被克隆并表达,而根据数据库比对发现,仍有一个未知的果聚糖外切水解酶基因未被研究,因此本实验对这对未知基因进行了探索。主要研究结果如下:1.纯化的重组酶Ht1-FEH Ⅱ在40℃以下很稳定,而Ht1-FEHI在35℃以上酶活有明显的下降。在pH4～8之间,重组蛋白Ht1-FEHI和II的酶活均较稳定,1.0 mM的Li+、Ca2+、K+、Na+、Mg2+和Co2+对重组酶Ht1-FEHI和II有不同程度的激活作用,而Fe2+和Cu2+对重组酶1-FEHs酶活有一定抑制作用。SDS对重组菊芋Ht1-FEHs酶活有明显的抑制作用,而EDTA和PMSF对重组酶酶活的影响不明显。酶的动力学研究发现:Ht1-FEHI 的 Km 为 0.68mg/ml,Vmax 为 0.00129mg/min;Ht1-FEHⅡ 的 Km 为0.92mg/ml,Vmax 为 0.0048mg/min。2.将Ht1-FEH Ⅰ和Ht1-FEH Ⅱ分别转入酿酒酵母6525中异源表达,测得其酶活分别为2.44±0.069(U/ml)和2.98±0.009(U/ml),远远高于野生型酵母的酶活,说明菊芋的FEHs在酿酒酵母中异源表达。而转化子Ht1-FEH Ⅰ和Ht1-FEH Ⅱ在pH6和30℃的产乙醇量分别为CK的125%和127%,显著提高了乙醇产量。pH5和35℃以及部分金属离子对乙醇的产量均有抑制作用。3.通过与我们的菊芋转录组的数据比对,发现了一条不同于Ht1-FEH Ⅰ和Ht1-FEHⅡ的同源FEH基因,对其进行了克隆,发现其第一个应为NDPNG的保守区域的氨基酸序列与Ht1-FEH Ⅰ和Ht1-FEH Ⅱ不同有一个氨基酸的不同(第一个N),于是对其基因序列做了定点突变处理,并再一次诱导表达,发现并无酶活。将这条序列与韩国的菊芋转录组序列进行比对,发现少扩增了 200bp的序列,这有可能是诱导出的重组酶无酶活的原因。