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本实验以小鼠肺上皮细胞MLE-12细胞系以及卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘小鼠模型为研究对象,研究姜酮对过氧化应激导致的细胞损伤的保护作用和对哮喘小鼠模型的影响以及潜在分子机制。本实验共分3个部分:(1)姜酮通过抑制NF-κB信号通路的活化保护MLE-12细胞免受氧化应激诱导的细胞损伤为了找出对细胞活性无影响的姜酮刺激浓度,我们用20μM,50μM,100μM,200μM,500μM的姜酮分别刺激MLE-12细胞,结果发现与对照组相比,姜酮浓度不高于200μM时,对细胞活力无明显影响(P>0.05),当加入姜酮的浓度为500μM时,细胞活力出现明显下降(P<0.05),因此之后的实验选取姜酮刺激浓度为20-200μM;通过H2O2刺激细胞制造细胞过氧化损伤模型,被H2O2刺激后的细胞活力明显下降(P<0.05),在治疗组,姜酮显著减轻H2O2诱导的细胞活力的下降,并呈浓度依赖性(P<0.01)。ROS水平检测、过氧化水平检测以及LDH活性测定的结果发现,姜酮可以减轻H2O2诱导MLE12细胞产生的活性氧水平升高、MDA水平升高、SOD表达下降和LDH的活性升高,并且呈浓度依赖性。线粒体膜电位的检测结果发现姜酮以浓度依赖的方式减少CCCP导致线粒体膜电位的丧失,当姜酮浓度为200μM时,CCCP导致线粒体膜电位丧失的水平最低。免疫印迹试验提示与阳性对照组相比,姜酮以浓度依赖的方式抑制了LPS诱导的p-IκB、p-p65以及细胞核内的p65的表达,差别具有统计学意义(P<0.05)。ELISA实验发现姜酮以浓度依赖的方式降低了H2O2诱导的MLE-12细胞培养液上清中的IL-1β和TNF-α的水平(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测发现姜酮降低了MLE-12细胞中IL-1β和TNF-α的m RNA的表达水平,并且同样呈浓度依赖性(P<0.05)。实验说明姜酮可以通过抑制经典的炎症反应途径NF-κB信号通路发挥对细胞氧化应激损伤的保护作用,同时减少活性氧及炎性细胞因子的产生,提高抗过氧化酶活性。(2)姜酮通过激活Nrf2/HO-1通路改善哮喘小鼠的气道炎症及气道重塑通过卵清蛋白(OVA)致敏混悬液腹腔注射及5%OVA雾化吸入的方式建立哮喘小鼠模型,并将小鼠随机分为对照组(control)、模型组(OVA)、姜酮50mg/kg体重治疗组(OVA+ZIN50)以及姜酮100mg/kg体重治疗组(OVA+ZIN100)。通过无创全身体积描记系统检测哮喘小鼠的气道高反应性发现,OVA+ZIN100组小鼠的Penh值低于OVA+ZIN50组及OVA组,与OVA组相比,差别有统计学意义(P<0.05);小鼠肺泡灌洗液细胞分类计数结果发现,姜酮可明显降低肺泡灌洗液中的中性粒细胞及嗜酸性粒细胞计数,与OVA组比较,差别具有统计学意义(P<0.05),并且呈剂量依赖性改变。对小鼠灌洗液上清中细胞因子检查发现,姜酮治疗组小鼠肺泡灌洗液上清中IL-4、IL-5及IL-13水平较OVA组明显下降(P<0.05),同时IFN-γ水平与OVA组比较明显升高(P<0.05),同样呈剂量依赖性。免疫印迹试验结果发现姜酮治疗组小鼠肺组织中p-p65及p-lκB表达下调,与OVA组比较差别有统计学意义(P<0.01),同样呈给药剂量依赖性变化,OVA+ZIN100组p-p65及p-lκB表达水平低于OVA+ZIN50组小鼠。免疫组化检查发现姜酮以治疗剂量依赖的方式抑制p65蛋白转入细胞核。组织切片染色发现,姜酮有效的减少了哮喘小鼠气道炎性细胞浸润,杯状细胞增生以及小气道周围组织纤维化的改变。体外免疫印迹试验发现姜酮以浓度依赖的方式上调核内Nrf2蛋白及HO-1蛋白水平,与对照组有明显差异(P<0.01);体内试验发现姜酮明显上调了哮喘小鼠核内Nrf2蛋白及HO-1蛋白的表达水平,与OVA组有显著差异(P<0.01),上调方式同样呈给药剂量依赖性。免疫组化检查发现姜酮以剂量依赖的方式增加了Nrf2蛋白转入细胞核以及HO-1蛋白的表达。研究证明,激活Nrf2/HO-1途径可能姜酮减轻哮喘气道炎症及气道重塑的潜在机制。(3)姜酮通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路发挥作用MLE-12细胞分为对照组(control)、治疗组(ZIN100)和治疗+Compound C组(ZIN100+CC)。小鼠随机分为姜酮100mg/kg体重治疗+Compound C治疗组(OVA+ZIN100+CC)和姜酮100mg/kg体重治疗+Nrf-2敲除组(OVA+ZIN100+Nrf-2Len)。体外实验发现ZIN100+CC组细胞活力较ZIN100组明显下降,ZIN100+CC组细胞SOD活性下调,LDH活性及MDA水平明显升高(P<0.05)。免疫印迹试验结果发现,ZIN100组细胞的磷酸化AMPK(p-AMPK)蛋白水平较对照组明显升高(P<0.05),经Compound C处理后,p-AMPK水平下调,同时伴有核内Nrf2蛋白水平及HO-1蛋白水平明显下调(P<0.05)。体内实验发现,与OVA+ZIN100组比较,OVA+ZIN100+CC组和OVA+ZIN100+Nrf-2Len组肺泡灌洗液上清中IL-4、IL-5及IL-13水平明显升高(P<0.05),IFN-γ水平明显下降(P<0.05)。组织染色结果发现,与OVA+ZIN100组比较,无论给予Compound C腹腔内注射处理还是Nrf2 sh RNA慢病毒气道内滴入,均可以导致小鼠哮喘模型的气道上皮中炎性细胞明显增多,杯状细胞明显增生及小气道周围组织纤维化加重。免疫印迹试验结果提示与姜酮治疗组比较,Compound C处理组小鼠肺组织中细胞核内Nrf2蛋白及p-AMPK蛋白表达水平均下调(P<0.01),而Nrf2sh RNA慢病毒处理组仅对核内Nrf2蛋白表达水平下调(P<0.05),但对上游蛋白p-AMPK蛋白表达水平无明显影响。实验结果证明姜酮通过AMPK/Nrf2/HO-1途径发挥对细胞过氧化损伤的保护作用以对哮喘小鼠的治疗作用。