背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内最常见且恶性程度最高的肿瘤之一,其病因复杂且致病因子多,目前尚无有效的治疗措施。深入研究HCC形成和发展的分子机制,针对其发病特异性环节开发治疗HCC的新药已成为当前的迫切需要。转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)信号通路是当前研究的与HCC发生发展最为紧密的信号通路之一,在肿瘤的发生发展中扮演着非常重要的角色。TGF-β信号对HCC的作用随HCC发展阶段不同而异,在HCC早期,TGF-β1可抑制细胞增殖,HCC晚期TGF-β1则促进肿瘤进展和转移。目前认为,这样看似矛盾的双重作用与Smad3 C末端或L区磷酸化有关,p Smad3C传递生长抑制信号,p Smad3L传递促肿瘤发生信号,p Smad3C向p Smad3L的转化是HCC发病的重要环节。微小核糖核酸(micro RNA,mi RNA)是一类广泛存在于各种生物中的内源性非编码单链RNA,与肿瘤的发生密切相关。在HCC中,mi R-21和mi R-145是表达水平改变较明显且对疾病影响较大的一组mi RNA。mi R-21通过对靶基因的调控发挥促癌作用,而mi R-145具有明显的抗癌作用。课题组前期研究表明,mi R-145/mi R-21与p Smad3C/p Smad3L之间存在相互调控作用,这种交互作用能够影响着HCC的进程,干预二者之间的交互作用促进HCC的转归,成为HCC治疗的新的可能靶点。本课题组前期系列研究显示,复方芪参提取物(Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract,CASE)在体内外HCC模型中均展现出良好的抗HCC效应,其药物作用的发挥可能与促进p Smad3C表达,抑制p Smad3L表达有关;近期研究显示在DEN诱导的大鼠肝癌模型和TGF-β1刺激的Hep G2细胞中,CASE能够提高mi R-145的表达水平同时降低mi R-21的表达。推测mi R-145/mi R-21与p Smad3C/p Smad3L之间的交互作用可能是CASE抗HCC的重要机制。本课题拟在用Smad3C/Smad3L磷酸化位点突变质粒及mi R-145 antagomir/mi R-21 agomir干预的Hep G2细胞和荷瘤裸鼠模型中,进一步观察CASE的抗HCC作用,探讨其抗HCC作用的潜在机制。目的1.在mi R-145低表达或mi R-21高表达的Hep G2细胞和肝癌裸鼠移植瘤模型中,观察CASE对细胞生物学行为和裸鼠移植瘤生长的影响,以证明其抗HCC作用与mi R-145/mi R-21的关联性;2.在mi R-145低表达或mi R-21高表达的Hep G2细胞和肝癌裸鼠移植瘤模型中,观察CASE对TGF-β信号通路的影响,以证明CASE抗HCC作用与mi R-145/mi R-21调控TGF-β信号通路的关联;3.在Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A三种质粒稳转Hep G2细胞和对应的肝癌裸鼠移植瘤模型中,观察CASE的药物作用以及对mi R-145/mi R-21表达的影响,以证明CASE抗HCC作用与TGF-β信号通路调控mi R-145/mi R-21表达的关联;方法1.mi R-145低表达或mi R-21高表达的Hep G2细胞模型的建立,观察并探讨CASE对细胞生物学行为的影响及其可能的机制采用脂质体法将mi R-145 antagomir、mi R-21 agomir及相应的阴性对照antagomir NC、agomir NC转染至Hep G2细胞中,给予CASE(80μg/ml,根据量效关系确定的最佳浓度)处理24小时,其余组加入等体积溶媒同步处理,不同实验给予不同浓度的TGF-β1刺激不同时间。MTT法检测细胞增殖情况;细胞划痕实验观察细胞移行情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;q RT-PCR法检测细胞中mi R-145、mi R-21表达水平;Western blot法检测细胞中TβRII、Smad3、p Smad3C、p Smad3L、p ERK1/2、ERK1/2、p JNK1/2、JNK1/2、pp38、p38蛋白水平。2.mi R-145低表达或mi R-21高表达的肝癌裸鼠移植瘤模型的建立,观察并探讨CASE对移植瘤生长的影响及其可能的机制雄性BALB/c裸鼠36只,随机分组:antagomir NC组、mi R-145 antagomir组、mi R-145 antagomir+CASE组、agomir NC组、mi R-21 agomir组、mi R-21 agomir+CASE组,6只/组。以9×106 Hep G2细胞接种于裸鼠右侧腋下建立荷瘤模型,接种细胞第8天起,分别向瘤体内注入antagomir NC、mi R-145 antagomir、agomir NC、mi R-21 agomir 20μl(0.05μmol/ml),每4天1次,共7次。药物组于细胞接种当天开始给予CASE(310 mg/kg,根据预实验确定的最佳剂量)处理,模型组给予等量溶媒(CMC-Na),每日灌胃一次,共36天。36天后处死小鼠,称量瘤块重量,排水法测瘤块体积;HE染色法评估各组瘤块病理学改变;q RT-PCR法检测瘤块中mi R-145、mi R-21表达水平;Western blot法检测瘤块中TβRII、Smad3、p Smad3C、p Smad3L、p ERK1/2、ERK1/2、p JNK1/2、JNK1/2、pp38、p38蛋白水平。3.CASE对Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A三种质粒稳转Hep G2细胞中mi R-145和mi R-21表达的影响Smad3 WT-Hep G2、Smad3 EPSM-Hep G2、Smad3 3S-A-Hep G2细胞株由本课题组前期采用脂质体转染法将携带Smad3不同磷酸化位点基因的质粒转入人肝癌Hep G2细胞株,经G148筛选获得。取上述三种质粒稳转细胞株常规培养,CASE(80μg/ml,根据量效关系确定的最佳浓度)处理24小时,其余组加入等体积溶媒同步处理,TGF-β1(9 pmol/L)活化。q RT-PCR法检测细胞内mi R-145、mi R-21表达情况。4.Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A三种质粒稳转Hep G2细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立,观察并探讨CASE对移植瘤生长的影响及其可能的机制雄性BALB/c裸鼠48只,随机分组:Hep G2组、Hep G2+CASE组、Smad3WT-Hep G2组、Smad3 WT-Hep G2+CASE组、Smad3 EPSM-Hep G2组、Smad3EPSM-Hep G2+CASE组、Smad3 3S-A-Hep G2组、Smad3 3S-A-Hep G2+CASE组,6只/组。各稳转细胞株以9×106细胞量接种于相应组别裸鼠右侧腋下建立荷瘤模型,接种当天给予CASE(310 mg/kg,根据预实验确定的最佳剂量)处理,模型组给予等量溶媒(CMC-Na),每日灌胃一次,共36天。36天后处死小鼠,瘤块称重、排水法测瘤块体积;HE染色法评估瘤块病理学特征;透射电镜观察瘤块细胞超微结构;q RT-PCR法检测瘤块中mi R-145/mi R-21表达水平;Western blot法检测瘤块中p Smad3C/p Smad3L蛋白水平。结果1.CASE对mi R-145低表达或mi R-21高表达的Hep G2细胞生物学功能的影响及对TGF-β信号通路的调控1.1 CASE对mi R-145低表达或mi R-21高表达的Hep G2细胞生物学功能的影响与antagomir NC组相比,mi R-145低表达显著促进TGF-β1诱导的Hep G2细胞的增殖(P<0.01)和移行能力(P<0.01),明显抑制细胞凋亡(P<0.01);CASE对mi R-145低表达所引起的促细胞增殖作用和促细胞迁移效应具有显著的抑制作用(P<0.01),同时显著提高细胞凋亡率(P<0.01)。与agomir NC组相比,mi R-21高表达显著促进TGF-β1诱导的Hep G2细胞的增殖能力(P<0.01)和移行能力(P<0.01),显著抑制细胞凋亡(P<0.01);CASE对mi R-21高表达所引起的促细胞增殖和促细胞迁移效应具有显著的抑制作用(P<0.01),同时显著提高细胞凋亡率(P<0.01)。1.2 CASE对mi R-145低表达或mi R-21高表达的Hep G2细胞中mi R-145/mi R-21表达水平的影响q RT-PCR检测显示,与antagomir NC组相比,mi R-145 antagomir降低Hep G2细胞中mi R-145的表达水平(P<0.01),CASE恢复并增加上述细胞内mi R-145的表达水平(P<0.01);与agomir NC组相比,mi R-21 agomir增加Hep G2细胞中mi R-21表达水平(P<0.01),CASE显著降低细胞内mi R-21 agomir上调的mi R-21表达水平(P<0.01)。1.3 CASE对mi R-145低表达或mi R-21高表达的Hep G2细胞内TGF-β信号通路相关蛋白表达的影响Western blot结果显示,TGF-β1刺激后,与antagomir NC组相比,mi R-145低表达显著增加Hep G2细胞内TβRII、p Smad3L、Smad3、p JNK1/2、pp38蛋白水平而降低p Smad3C蛋白水平,p ERK1/2蛋白水平无显著变化;CASE可反向改变mi R-145低表达引起的细胞内上述蛋白的表达,同时抑制细胞内p ERK1/2蛋白表达。TGF-β1刺激后,与agomir NC组相比,mi R-21高表达对Hep G2细胞内TβRII、p Smad3L、p ERK1/2、p JNK1/2、pp38蛋白表达具有促进作用,对p Smad3C、Smad3蛋白表达无明显影响;CASE对mi R-21高表达的Hep G2细胞内Smad3蛋白表达无影响,显著降低细胞内TβRII、p Smad3L、p ERK1/2、p JNK1/2、pp38蛋白水平同时促进p Smad3C蛋白表达。2.CASE对mi R-145低表达或mi R-21高表达的Hep G2细胞裸鼠移植瘤生长的干预2.1肝癌裸鼠移植瘤模型中,CASE对mi R-145低表达或mi R-21高表达的促肿瘤生长效应具有抑制作用裸鼠腋下接种Hep G2细胞,成功建立肝癌裸鼠移植瘤模型。与antagomir NC组相比,mi R-145 antagomir组移植瘤重量增加(P<0.01)、体积增大(P<0.01),mi R-145低表达显著促进移植瘤的生长;与mi R-145 antagomir组相比,mi R-145antagomir+CASE组移植瘤的重量明显减轻(P<0.01)、体积明显减小(P<0.01),CASE对mi R-145低表达的促肿瘤生长效应具有显著的抑制作用。与agomir NC组相比,mi R-21 agomir组移植瘤重量增加(P<0.01)、体积明显增大(P<0.01),mi R-21高表达能够显著促进移植瘤的生长;与mi R-21 agomir组相比,mi R-21 agomir+CASE组移植瘤的重量减轻(P<0.01)、体积明显减小(P<0.01),CASE对mi R-21高表达的促肿瘤生长效应具有显著的抑制作用。2.2 CASE对mi R-145低表达或mi R-21高表达的裸鼠移植瘤组织病理学的影响HE染色显示,与antagomir NC组相比,mi R-145 antagomir组肿瘤细胞生长旺盛,核分裂像增多,mi R-145低表达使得肿瘤细胞的活性增强。与mi R-145 antagomir组相比,mi R-145 antagomir+CASE组肿瘤细胞核固缩且伴有核碎裂,提示肿瘤细胞出现凋亡现象。与agomir NC组相比,mi R-21 agomir组肿瘤细胞排列密集,细胞体积大,核浆比例大,提示mi R-21高表达促进肿瘤细胞的生长。与mi R-21 agomir组相比,mi R-21agomir+CASE组瘤细胞可见较多核固缩及核碎裂现象,且细胞间有散在的无核的血细胞,提示肿瘤细胞凋亡坏死。2.3 CASE对mi R-145低表达或mi R-21高表达的裸鼠移植瘤组织中mi R-145/mi R-21表达水平的影响q RT-PCR检测显示,与antagomir NC组相比,mi R-145 antagomir组移植瘤组织中mi R-145表达水平显著降低(P<0.01),CASE恢复并增加移植瘤组织中原本下调的mi R-145表达水平(P<0.01);与agomir NC组相比,mi R-21 agomir组移植瘤组织中mi R-21表达水平显著升高(P<0.01),CASE明显降低移植瘤中原本上调的mi R-21表达水平(P<0.01)。2.4 CASE对mi R-145低表达或mi R-21高表达的裸鼠移植瘤中TGF-β信号通路相关蛋白表达的影响Western blot结果显示,与antagomir NC组相比,mi R-145低表达显著促进移植瘤中TβRII、p Smad3L、Smad3、p ERK1/2、p JNK1/2、pp38蛋白表达,显著抑制p Smad3C蛋白表达,ERK1/2、JNK1/2、p38蛋白表达无显著变化;CASE对mi R-145低表达的移植瘤内TβRII、p Smad3L、Smad3、p ERK1/2、p JNK1/2、pp38蛋白表达具有明显的抑制作用,同时升高p Smad3C蛋白水平;与agomir NC组比较,mi R-21高表达显著促进移植瘤内TβRII、p Smad3L、p ERK1/2、p JNK1/2、pp38蛋白的表达,而对Smad3、p Smad3C、ERK1/2、JNK1/2、p38蛋白水平无显著影响;CASE对mi R-21高表达的移植瘤内TβRII、p Smad3L、p ERK1/2、p JNK1/2、pp38蛋白表达具有抑制作用同时促进p Smad3C蛋白表达。3.CASE对Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A三种质粒稳转Hep G2细胞中mi R-145和mi R-21表达的影响q RT-PCR检测显示,CASE显著上调TGF-β1刺激下的三种质粒稳转Hep G2细胞中mi R-145的表达同时明显降低mi R-21的表达水平(P<0.01);以Smad3EPSM-Hep G2细胞株CASE作用最为明显,mi R-145水平显著增加而mi R-21水平显著降低;而CASE对Smad3 3S-A-Hep G2细胞株中mi R-145和mi R-21表达的调控作用最弱。4.CASE对三种质粒稳转的Hep G2细胞裸鼠移植瘤模型的干预作用4.1 CASE对三种质粒稳转的Hep G2细胞裸鼠皮下移植瘤生长及病理改变的影响裸鼠腋下接种各稳转细胞株,成功建立肝癌裸鼠移植瘤模型,CASE不同程度地抑制各组裸鼠皮下瘤块的生长,与Smad3 WT-Hep G2+CASE组相比,Smad3EPSM-Hep G2+CASE组瘤体重量和体积较小,而Smad3 3S-A-Hep G2+CASE组瘤体重量和体积则较大(P<0.01)。HE染色显示,较相应模型组,CASE干预可诱导各组细胞凋亡或坏死,以Smad3 EPSM-Hep G2+CASE组细胞凋亡和组织坏死最为明显,瘤块细胞胞核偏小,核固缩碎裂;而Smad3 3S-A-Hep G2+CASE组瘤块细胞凋亡最不明显,核大深染,核分裂像多。电镜检测结果与上述结果变化一致,以Smad3 EPSM-Hep G2+CASE组瘤块细胞空泡样变最为明显,凋亡小体数量最多;而Smad3 3S-A-Hep G2+CASE组瘤块细胞处于凋亡早期阶段,细胞稍有固缩,胞浆中可见少许空泡样病变,胞核完整。4.2 CASE对各组移植瘤中mi R-145/mi R-21表达水平的影响q RT-PCR检测显示,CASE显著促进各组瘤块中mi R-145表达而抑制mi R-21表达。其中CASE对Smad3 EPSM-Hep G2细胞移植瘤中mi R-145表达的促进作用及mi R-21表达的抑制作用最为明显,对Smad3 3S-A-Hep G2细胞移植瘤中mi R-145和mi R-21表达的调控作用最弱。4.3 CASE对各组移植瘤中p Smad3C/p Smad3L蛋白表达水平的影响Western blot检测显示,CASE促进各组瘤块中p Smad3C蛋白表达而抑制p Smad3L蛋白表达。与Smad3 WT-Hep G2+CASE组相比,Smad3 EPSM-Hep G2+CASE组瘤块中p Smad3C蛋白水平显著上调而p Smad3L蛋白水平显著下调,Smad3 3S-A-Hep G2+CASE组瘤块中p Smad3C/p Smad3L蛋白水平均下降。结论1.CASE通过促进mi R-145表达,经由TGF-β/Smad和MAPK信号通路间接促进p Smad3C蛋白表达同时抑制p Smad3L蛋白表达,促使p Smad3L向p Smad3C信号转换发挥抗HCC作用;2.CASE通过抑制mi R-21表达,抑制MAPK信号通路活化抑制p Smad3L蛋白表达,经由TGF-β/Smad信号通路间接促进p Smad3C蛋白的表达,促使p Smad3L向p Smad3C信号转换发挥抗HCC作用;3.选择性上调Hep G2细胞中p Smad3C蛋白表达,增强CASE的抗HCC作用,其机制可能与p Smad3C促进mi R-145表达同时抑制mi R-21表达有关;而选择性上调Hep G2细胞中p Smad3L蛋白表达,减弱CASE的抗HCC作用,与其抑制mi R-145表达同时促进mi R-21表达有关;总之,CASE在Hep G2细胞和肝癌裸鼠移植瘤模型上显示了良好的抗HCC作用。其一方面通过调控mi R-145/mi R-21表达,促使p Smad3L向p Smad3C信号转换发挥抗HCC作用;另一方面p Smad3C/p Smad3L调控mi R-145/mi R-21表达,增强或减弱CASE的抗HCC作用。即mi R-145/mi R-21与p Smad3C/p Smad3L的串话可能是CASE发挥抗HCC作用的重要分子机制。