外泌体起源于细胞内的多泡体,是一种几乎所有细胞均能释放的直径为30-100 nm的细胞外囊泡,在细胞间物质交流,信号调控和生理功能等方面发挥重要作用。近年来,干细胞来源的外泌体在治疗心肌梗死,缺血性损伤等疾病中均起到重要作用。与其来源的干细胞相比,外泌体不仅具有相同的有益功能,而且具有不触发免疫反应的特性,能够降低异源植入的潜在风险。因此,基于干细胞来源的外泌体已成为治疗缺血性心血管疾病的一种有效策略。但外泌体治疗也存在着一些和干细胞治疗相同的缺点:如血液注射靶向性差,原位注射驻留时间短,以及具有特定功能的分子含量不足等。在本研究中,我们采用外泌体原位注射来验证外泌体的治疗效果,并且为了改善外泌体的治疗效果对外泌体进行修饰改造,如提高外泌体的原位驻留时间,提高外泌体中功能性分子的含量,从而推动干细胞来源的外泌体在治疗缺血性损伤疾病中的临床转化。在我们的研究中发现,衰老和缺血性损伤可引起相似的分子和下游通路变化,且miR-675作为一种关键的上游分子,可以通过靶定TGF-β1-smad2/3信号通路来抑制衰老和损伤诱导的相关表型。遗憾的是,miR-675在外泌体中表达量较低,因此我们将miR-675 mimic转染到人脐带间充质干细胞中,收集的外泌体中含有大量的miR-675。为了进一步提高miR-675 Exo功能,我们使用丝素水凝胶包封外泌体来提高其原位驻留时间,结果表明miR-675 Exo 可以明显提高后肢缺血的恢复能力,丝素水凝胶包封miR-675 Exo能进一步促进后肢缺血的修复。近年来的研究表明丝胶并不引起免疫反应,因此我们进一步探索丝素丝胶复合水凝胶的免疫原性和向原位组织递送外泌体的可行性。我们将水溶性提取的丝素丝胶蛋白混合溶液通过超声形成丝素丝胶复合水凝胶,并通过冷冻干燥法获得水凝胶海绵。随后将丝素丝胶水凝胶海绵插入到小鼠后背全皮肤切除的伤口下,结果表明丝素丝胶水凝胶引起的免疫反应并未超过四层无菌纱布,同时能促进伤口处皮肤和毛发的生长,加入外泌体能进一步促进伤口愈合和毛发的生长,这表明丝素丝胶水凝胶海绵可以作为皮肤损伤的敷料,并且可以作为递送和缓释外泌体的潜在生物材料。在丝素水凝胶递送外泌体研究中,体外的外泌体缓释曲线表明前8天时可释放高达40%的外泌体。因此为了进一步提高外泌体的缓释率,我们新选用了一种功能性多肽水凝胶来包封外泌体。该多肽在可控降解的自组装两亲性肽的N末端添加心脏保护肽 GHRP6,序列为 C 1 6-Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Gly-Gly-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Ser(PA-GHRP6),可在强自组装肽NaPFF辅助下自主成胶和包封外泌体,并且可以通过可控降解释放外泌体和GHRP6。随后在心梗后心肌梗死边缘区注射包封外泌体的功能肽水凝胶,并检测对心肌梗死的治疗效果。结果表明含有10-3M PA-GHRPS的水凝胶可以明显改善心脏功能,抑制炎症反应和纤维化水平,加入外泌体的多肽水凝胶可以进一步提高对心梗的修复能力。结论:我们的研究结果证实,向外泌体来源的母细胞中转染功能性miR-675分子,可以获得高miR-675含量的外泌体,为外泌体的内部分子改造提供借鉴;此外丝素水凝胶和多肽水凝胶可以促进外泌体的缓释,丝素水凝胶具有优良的机械性能,而多肽水凝胶以其孔径小,在保证外泌体缓释时间方面有更好的效果,两种水凝胶各有优势,可根据不同需要选用合适的水凝胶类型。此外我们也验证了丝素丝胶复合水凝胶可以作为一种良好的伤口敷料,可在递送外泌体方面发挥一定的功能。总之,我们对外泌体使用外部水凝胶包封和内部分子改造两种方式,以此来提高原位注射的外泌体功能,为外泌体的转化研究提供借鉴。