LPS介导的TLR4信号通路在膀胱癌T24细胞免疫逃逸过程中的作用及其机制的实验研究

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目的:作为泌尿系统最常见的恶性肿,瘤,膀胱癌在其发生、发展以及复发过程中逃避机体免疫监督的诸多生物学行为正日益受到广泛关注。研究表明Toll样受体4(Toll-like receptor4, TLR4)在多种恶性肿瘤中存在表达并与某些肿瘤的分期分级密切相关,提示TLR4可能参与了肿瘤的免疫逃逸过程;而共刺激因子B7H1可与T淋巴细胞表面的PD-l结合并启动后者的凋亡过程,是免疫逃逸过程的重要分子。本研究的主要目的即探讨LPS介导的TLR4信号通路的活化与B7-H1表达的关系,并探讨他们参与膀胱癌免疫逃逸可能的分子机制。方法:1.体外培养膀胱癌T24细胞系,分别以不同浓度的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(0.0.25、0.5、0.75、1.0、2.0μg/ml)刺激T24细胞8h,以激活TLR4信号通路。用流式细胞学方法检测T24细胞表面TLR4的表达情况;分别提取总RNA,用逆转录聚合链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测共刺激因子B7H1mRNA的表达情况;提取蛋白质,用Western-blot蛋白印迹技术检测B7H1蛋白质的表达情况;2.以浓度1μg/ml的LPS分别刺激T24细胞不同时间(Oh、2h、4h、6h、8h、12h),以激活TLR4信号通路。用前述方法分别检测检测TLR4、 B7H1mRNA、B7H1蛋白质的表达情况;3.以浓度为1μg/ml的LPS分别刺激T24细胞不同时间(Omin、15min、30min、45min、60min、90min)、提取蛋白质,用Western-blot技术检测p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白的表达情况;4.分别用ERK、JNK、P38的特异性抑制剂(0、10、20、40μM)处理T24细胞2h后,再加入1μg/ml的LPS刺激20min,提取蛋白质,用western-blot技术检测p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白的表达情况;5.分别加入ERK、JNKP38的特异性抑制剂(0、10、20、40μM)2h后,再加入1μg/ml的LPS刺激T24细胞8h后提取蛋白质,用Western-blot技术检测B7-H1蛋白质的表达情况;结果:1.TLR4、B7-H1mRNA及蛋白质表达均随LPS刺激时间的延长或浓度提升而增加,并且在时间为8h、浓度为1.0μg/ml时达到高峰。且B7-H1mRNA及蛋白质表达分别与T24细胞表面TLR4的表达呈正相关;2.LPS激活TLR4信号通路后,MAPK信号通路中的ERK、JNK、p38的磷酸化水平有不同程度的提高;3. ERK、JNK、p38的特异性抑制可明显降低三者的磷酸化水平。4.特异性的抑制ERK, JNK的活化可降低LPS激活TLR4信号通路后对B7-H1表达的上调;而抑制P38的磷酸化这种作用则不明显。结论:1.TLR4信号通路的活化可通过上调B7-H1的表达参与膀胱肿瘤的免疫逃逸机制。2. MAPK信号通路中的ERK、JNK等的活化可能参与了TLR4信号对B7-H1表达的上调机制
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