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性早熟差异表达基因的克隆和鉴定及滋阴泻火中药合剂对差异基因的影响 性早熟是一种生长发育异常性疾病，男女儿童中本病的发病率约为0.6％。但真性性早熟的病因仍不清楚。本实验应用分子生物学、免疫组织化学等实验方法，在达那唑诱导的性早熟大鼠模型上，克隆和鉴定性早熟大鼠下丘脑差异表达的基因，并初步观察了模型鼠和患儿外周血单个核细胞中差异基因的表达，以探讨性早熟的发病机制和中药治疗性早熟的机理。实验结果如下： 1．5日龄雌性大鼠皮下注射达那唑后，大鼠阴门开启和出现第一个性周期的时间分别为25.97±2.24天和32.43±0.75天，比正常组的34.00±0.98天和41.26±2.35天及载体组的34.33±1.09天和40.00±0.19天均显著提前(P＜0.01)：模型组大鼠出现第一个动情周期时，卵巢和子宫的脏器系数也分别比正常组和载体组的明显增加(P＜0.01)。另外模型组大鼠阴道脱落上皮细胞的形态学周期性变化和正常成熟大鼠的相似。结果提示，达那唑可诱导雌性大鼠的性发育显著提前，该模型是一种较理想的真性性早熟大鼠模型。 2．应用随机引物PCR(RNA arbitrarily primed PCR,RAP-PCR)方法从达那唑诱导的性早熟模型大鼠下丘脑共分离得到5条差异表达基因的cDNA片段，其中包括生殖调控体系的关键分子GnRH的cDNA。本文应用Dot blot鉴定了GnRHmRNA在大鼠下丘脑的表达，发现模型组下丘脑GnRHmRNA的表达呈上调趋势。另外一条差异表达基因，我们将其命名为IPP-1(idiopathic precocious puberty)，Blast检索GeneBank发现，其与homo sapiens KIAA1538基因的同源性达84％，应用Dot blot和Northern blot分析发现，IPP-1mRNA在模型组大鼠下丘脑的表达下调。 3．应用RT-PCR方法观察到，滋阴泻火中药合剂可下调下丘脑GnRHmRNA和垂体GnRH受体mRNA的表达。应用免疫组织化学研究发现，滋阴泻火中药合剂可以诱导性早熟模型大鼠下丘脑GnRH免疫阳性细胞数增加，我们推测滋阴泻火中药合剂可能通过抑制下丘脑GnRH的释放，缓解提前启动的下丘脑—垂体—性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonad axis, HPGA)功能。另外，滋阴泻火中药合剂可显著上调性早熟差异基因IPP-1的表达。提示滋阴泻火中药合剂可在分子水平通过调整异常的基因表达，使HPGA的异常功能趋于正常化。性旱熟差异表达基因的克隆和鉴定及滋阴泻火中药合剂对差异基因的影响4.应用RT一PCR的方法观察到，在大鼠及不同年龄和性早熟儿章外周血单个核，细胞内均有GnRJlmRNA的表达，模型组大鼠其表达增加，性早熟患儿(，1=2)外周血单个核细胞内GnRHmRNA的表达较正常发育儿童(4岁、6岁、8岁)有升高趋势。我们推测外周组织细胞产生的GnRH可能通过旁分泌作用J几垂体之外的组织细胞上的GnRH受体，调节卵巢卵泡的发育和性街体激素的产生。虽然在外周血单个核细胞内观察到了KIAA1538mRNA的表达，但儿童及大鼠各组之间表达水平无显著差异。 总之，儿童性早熟可能是一种涉及到基因调控和表达的疾病，滋阴泻火中药合剂可从分子水平，在多个层次调整异常的HPGA功能。