背景长期以来，重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）一直是胰腺外科工作者争论和研究的热点问题，尤其对SAP合并弥漫性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）缺乏深入的研究。当出现血栓所致的多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）、出血症状明显、实验室指标出现血小板减少、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）延长、纤维蛋白原减少、纤维蛋白降解产物升高、3P试验阳性时，DIC已经发展到了中晚期（即血小板、凝血因子消耗期或纤溶亢进）阶段，这时往往失去了治疗的最佳时机，使治疗变得困难而复杂，治愈率明显降低。故早期诊断、早期预防是DIC治疗的重要环节。近年研究认为：SAP时，凝血激活和内皮损伤是DIC形成的关键，而DIC凝血激活反应机制中组织损伤起了非常重要的作用。SAP患者机体中白细胞过度激活、血浆中大分子增加使细胞间发生聚集；另一方面，由于炎症介质、胰酶和氧自由基、血小板活化因子、磷脂酶A₂（phospholipaseA₂，LPA₂）等损伤内皮细胞，损伤后导致组织因子（tissue factor，TF）的异常分泌，进而启动凝血过程是引起DIC的主要机制。凝血过程是通过内源性和外源性凝血系统被激活而引起的，有相关报道，内源性凝血系统不是体内血栓形成有意义的过程，而外源性凝血系统才是体内血栓形成的重要途径。外源性凝血系统由血管壁等组织损伤后释放TF所触发，在正常情况下，内皮细胞屏障将循环血液与TF分开，当组织损伤破坏了此屏障时，TF得以与血液中的因子Ⅶ／Ⅶα结合。TF的细胞外区作为因子Ⅶ／Ⅶα的受体，X线衍射分析显示：TF与FⅦα接触的区域从TF细胞外羧基端的基底部向上延伸到其顶部的氨基端区，对FⅦα有很高的亲和力，当它与FⅦ或FⅦα形成复合物，在Ca²⁺存在的情况激活因子Ⅹ（FⅩ）和Ⅸ（FⅨ），在启动外源性凝血途径的同时也启动内源性凝血途径，进而导致体内凝血酶的产生。而凝血酶的生成是通过自动催化和反馈机制来调节控制的，早期生成的少量凝血酶通过激活因子Ⅴ、Ⅷ和血小板，加速因子Ⅹ和凝血酶原的激活，使局部迅速生成大量凝血酶，纤维蛋白原转变成纤维蛋白，血液凝固形成血栓。由此可见，凝血过程是以TF作为启动因子激活凝血酶原的一系列反应，说明下调TF的表达可以阻断凝血过程，从某种程度上可抑制DIC的发生和发展。动物实验研究证明，益母草（motherwort）有改善机体微循环、改善血液流变学、抗氧自由基及减少细胞内钙超负载自主作用，同时研究发现，益母草有明显的抑制血栓形成的作用。前文所述，内皮细胞释放TF在血栓形成的过程中起着重要作用，因此推测，益母草可能通过作用于血管内皮细胞，影响内皮细胞TF基因的转录和表达而阻止凝血过程。本课题通过设计以下实验来证明益母草对SAP时DIC形成的作用：（1）首先，进行人脐静脉内皮细胞（humanumbilical vein endothelial cells，HUVECs）原代培养、鉴定，并以凝血酶诱导第2代的HUVECs，观察凝血酶诱导HUVECs TF表达的情况。（2）在益母草不同浓度和不同时间的作用下，对HUVECs TF表达的情况进行分析，寻求益母草对凝血酶诱导下HUVECs TF表达的最大抑制效应所需的浓度和时间；进一步研究益母草在此浓度和作用时间对凝血酶诱导下HUVECs TF表达和TF mRNA转录的作用。（3）探讨益母草对SAP大鼠模型DIC形成的干预情况。目的1利用HUVECs的体外培养模型，观察在凝血酶诱导下HUVECs TF表达的情况。2寻求益母草对HUVECs TF表达的最大抑制效应所需的浓度和时间；研究在此浓度和作用时间下，益母草对凝血酶诱导下HUVECs TF表达和TFmRNA转录的作用。3研究益母草对SAP大鼠模型早期DIC形成的干预情况。方法1以胶原酶消化收集HUVECs，用F12K培养基加10％的胎牛血清进行培养，光学显微镜、免疫细胞化学方法鉴定内皮细胞，并用流式细胞仪检测细胞粘附分子CD105、CD31在内皮细胞的表达，进一步对HUVECs加以鉴定；将每条脐带分离、培养所得HUVECs分为2份，8条脐带共16份，将16份细胞随机配对分成甲、乙2组。甲组加凝血酶至终浓度25 IU／ml，培养10 h；乙组加等量磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）培养10 h。然后采用免疫荧光法在流式细胞仪上测定TF抗原，比较凝血酶与PBS作用下HUVECsTF的表达。用配对t检验统计方法进行分析。2把通过凝血酶（25IU／ml）作用10 h的细胞冻融液分成128份，每32份为一大组，共4组，再分别与浓度为2.5、5.0、7.5、10.0ug／ml的益母草作用；每大组再分成4小组（每组8份），益母草作用时间分别为6h、12h、24h、36h，通过免疫荧光法在流式细胞仪测定TF抗原，运用析因分析统计方法，分析益母草在不同浓度和不同作用时间对凝血酶诱导下HUVECs TF表达的作用。3将HUVECs的细胞冻融液分成3组：凝血酶＋益母草组（A组）：凝血酶25IU／ml培养10 h后加益母草5.0μg／ml培养24 h。凝血酶＋PBS组（B组）：凝血酶25IU／ml作用10 h，再加等量的PBS培养24 h。空白对照组（C组）：每步只加等量的PBS培养24 h。运用RT-PCR技术测定HUVECs TF mRNA转录和血凝检测仪自动检测活化因子Ⅶ（FⅦα）。统计方法用One-wayANOVA方差分析，如果差异有统计学意义（P＜0.05），则采用SNK检验，比较两两间的差别。4将75只Wistar大鼠随机分为5组：假手术组（SO组）（n=15）：仅行开腹翻动胰腺后关腹。SAP对照组（n=15）：逆行胰胆管注射5％牛磺胆酸钠制成SAP模型，术后右颈静脉注射生理盐水作为对照。DDFA组（n=15）：制成SAP模型后右颈静脉注射DDFA（D：Dexamethasone，地塞米松：D：Dextran，低分子右旋糖酐；F：5-fluorouracil，5-氟脲嘧啶；A：Aprotininum，抑肽酶）。DDFAM组（n=15）：制成SAP模型后右颈静脉注射DDFA＋益母草。益母草组（n=15）：制成SAP模型后右颈静脉注射益母草。SO组、SAP组、DDFA组、DDFAM组、益母草组分别于术后6 h、12 h、24 h，经下腔静脉取血标本检测TF、血浆抗凝血酶Ⅲ（antiprothrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ）、血浆凝血酶原片段_1＋2(plasma prothrombinfragment，F_1＋2)、PT，分析大鼠模型凝血功能的情况。取下腔静脉血测定血清中淀粉酶（amylase，AMY），分析益母草对SAP大鼠模型血清中AMY的作用情况。统计方法采One-way ANOVA方差分析，如果差异有统计学意义（P＜0.05），则用SNK检验两两间的差别。并每组分别于术后6 h、12 h、24 h取胰腺组织行病理形态学检查。结果1 HUVECs生长良好，成活率高，第7天光镜下HUVECs呈铺路石改变，荧光显微镜下可见培养的HUVECs胞浆内有绿色荧光，证实其为内皮细胞，而空白对照无荧光。流式细胞仪检测HUVECs CD105和CD31表达率，CD105⁺表达百分率为97.31％，CD31⁺92.02％。凝血酶与PBS作用下HUVECs TF表达结果运用配对t检验进行统计学分析，t=22.69，P＜0.01，两组间存在显著性差异。2不同浓度的益母草对凝血酶所诱导的HUVECsTF表达的作用不全相同（P＜0.01），益母草作用时间的不同对凝血酶所诱导的HUVECsTF表达的作用也不全相同（P＜0.01），而两因素间不存在交互效应（P＞0.05）。3 A组、B组、C组3组之间TF表达的比较，F值为408.07（P＜0.01），具有显著性差异，SNK检验进一步两两比较，B组的TF表达高于A组、C组的TF表达（P＜0.01）；TFmRNA／GAPDHmRNA灰度比值的比较，F值为48.81（P＜0.01），具有显著性差异，SNK进一步两两比较，B组的TF表达高于A（P＜0.01），具有显著性差异，SNK进一步两两比较，B组的TF表达高于A组、C组的TF表达（P＜0.01）。4在6 h、12 h、24 h各时间点，SO组、SAP组、DDFA组、DDFAM组、M组（以下简称5组）大鼠的血清AMY含量比较，各时间点的F值分别为86.61、114.20、241.54，P值均＜0.01，SNK检验各时间点组间差别有统计学意义（P＜0.01）。在6h、12h、24h各时间点，SO组、SAP组、DDFA组、DDFAM组、M组（以下简称5组）大鼠的血浆TF含量比较，各时间点的F值分别为99.98、193.66、77.80，P均＜0.01，有统计学意义，进一步两两比较显示：各时间点组间差别有统计学意义（P＜0.01），6h、12h各组间TF的表达由高到低依次是：SAP组＞DDFA组＞M组＞DDFAM组＞SO组；24 h各组间TF的表达由高到低依次是为：SAP组＞DDFA组＞M组＞DDFAM组、SO组。在6h、12 h、24 h各时间点，5组大鼠的血浆F₁₊₂含量比较，各时间点的F值分别为37.44、36.98、113.53，P均＜0.01，有统计学意义，进一步两两比较显示：各时间点组间差别有统计学意义（P＜0.01），6 h、12 h各组间F₁₊₂的含量由高到低依次是：SAP组、DDFA组＞M组＞DDFAM组、SO组；24h各组间F₁₊₂的含量由高到低依次是为：SAP组、DDFA组＞M组＞DDFAM组＞SO组。在6h、12 h、24 h各时间点，5组大鼠的血浆AT-Ⅲ活性比较，各时间点的F值分别为11.94、14.80、37.26，P均＜0.01，有统计学意义，进一步两两比较显示：各时间点组间差别有统计学意义（P＜0.01），6 h，AT-Ⅲ活性由高到低依次是：SAP组、DDFA组＞M组、DDFAM组、SO组。6h、12h，AT-Ⅲ活性由高到低依次是：SAP组、DDFA组＞M组、DDFAM组＞SO组。在6h、12h、24h各时间点，5组大鼠的血浆PT比较，各时间点的F值分别为0.82（P＞0.05）、1.75（P＞0.05）、56.91（P＜0.01），进一步两两比较显示：在24h，组间有显著性差异：SAP组的PT比DDFA组长，DDFA组的PT比DDFAM组、M组、SO组长。结论1 F12K培养基适合于HUVECs的培养。HUVECs在PBS的情况下可以表达微量的TF，而在凝血酶的诱导下表达大量的TF。2益母草可以抑制凝血酶诱导下HUVECs TF的表达，而且它的抑制效应与不同的作用时间和不同浓度有关。在相同的作用时间下，浓度较低时，随浓度升高益母草对HUVECs表达TF的抑制效应增强，当浓度大于5.0μg／ml时，益母草的抑制效应不再随浓度升高而变化；在相同的浓度下，当作用时间小于24h，益母草对HUVECs表达TF的抑制效应随时间的延长而增强，当作用时间为24h，效应达到最大。所以，在浓度为5.0μg／ml、作用时间为24h的条件下，益母草对凝血酶诱导下HUVECs TF的表达抑制效应达到最强。实验结果还表明，益母草抑制凝血酶诱导下HUVECs TF的表达是通过抑制HUVECsTFmRNA的转录来实现的。3在SAP大鼠模型中，虽然益母草不能单独控制SAP的炎症，但益母草加上SAP常规治疗可以降低TF的表达，下调SAP大鼠模型凝血系统中的F₁₊₂、AT-Ⅲ，使PT不继续延长，从而干预DIC的发生和发展。