论文部分内容阅读
研究背景肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma cell,HCC)因其复杂性、手术切除后易复发、转移等特点,是最致命的肿瘤疾病之一。肝细胞肝癌是全球第六大常见癌症,在癌症相关死亡中排名第三。亚洲和非洲国家HCC发展的刺激因素有慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、慢性饮酒、黄曲霉毒素污染的食物摄入、其他遗传性疾病(如体内铁超载引起的血色素沉着症)和肝硬化等。由于肝细胞肝癌发病因素复杂,发病机制尚不明确,给肝癌的治疗带来巨大的难题。众所周知,癌症患者不仅饱受病魔带来的痛苦,还要面对巨额医疗费用,癌症对于人们带来的损失是巨大的。因此积极寻找更多良好的肿瘤的治疗方法迫在眉睫。随着2018年诺贝尔生理学奖的颁布,肿瘤免疫治疗将进入一个新的时代。免疫检查点阻断疗法也得到了越来越多的关注。免疫检查点分子程序性死亡分子1(Programmed death-1,PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)等激活后对活化的T细胞有负性调节作用,可以降低T细胞活性甚至使其凋亡,抑制T细胞抗肿瘤免疫。PD-1最重要的配体是PD-L1,肿瘤细胞表达的PD-L1能够与T细胞表达的PD-1相结合,抑制T细胞的增殖,抑制细胞毒性介质的分泌,诱导T细胞发生凋亡,从而使其对肿瘤细胞的杀伤作用受到限制。CTLA-4与抗原提呈细胞(APC)表面的B7分子配体结合后,可以诱导T细胞无反应性,使抗原提呈细胞激活的T细胞减少,从而抑制T细胞的免疫应答,负调控抗肿瘤免疫。B7H3是一种免疫共抑制分子,能够诱导细胞免疫和选择性地增强IFN-y生产的细胞信号,从而抑制T细胞的抗肿瘤免疫。B7H4通常表达于抗原提呈细胞和T淋巴细胞表面,对T细胞的增殖、细胞因子分泌和免疫毒性均有抑制作用。肿瘤细胞表面表达CD47分子能够与巨噬细胞上SIRPα的的受体结合会抑制巨噬细胞的吞噬作用,导致肿瘤的免疫逃避。HVEM和T细胞衰减因子相结合后,可以向细胞传递负向调控的刺激信号,从而抑制细胞的增殖及免疫应答能力。有研究表明BTLA/HVEM通路(B和T淋巴细胞衰减器/疱疹病毒进入介质)在肿瘤微环境中对T细胞的抑制起着关键作用。在肿瘤微环境中,Galectin-9通过调节肿瘤细胞及免疫细胞的生存、增殖与迁移对肿瘤免疫发挥着重要的作用。目前关于PD-1和CTLA-4免疫检查点的抗体已经问世,这对肿瘤患者来说是莫大的福音。尽管靶向PD-L1/PD-1途径的抗体具有良好疗效,但还存在不足之处。除了部分病例对抗体治疗不敏感或者产生耐药性之外,抗体治疗还可带来较多免疫相关副作用,如甲状腺功能低下、肺炎、结肠炎和下垂体炎等。并且单抗药物治疗费用高昂,给患者带来难以承受的经济负担。由于免疫检查点分子在肿瘤免疫逃逸中的重要作用和目前临床抗体治疗中存在的问题,免疫检查点分子在肿瘤细胞表达的调控机制值得研究关注。弄清它们在肿瘤细胞表达的调控机制,则可能有助于发现更多、更有效的以之为靶点的免疫治疗方法。肿瘤微环境是指肿瘤细胞所处的局部组织环境,不仅包括肿瘤细胞,还有周围的免疫细胞和炎性细胞、成纤维细胞等以及附近的细胞间质、微血管以及浸润在其中的生物活性分子。其中,肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中发挥着重要作用。前期研究我们发现M1型巨噬细胞上清可以诱导肝癌细胞高表达PD-L1分子,但是,M1型巨噬细胞能否诱导肝癌细胞高表达其他的免疫检查点分子PD-L2,B7-H3,B7-H4,CD48,CD47,HVEM 和 Galectin9 呢?有研究表明,在感染或疫苗接种后,典型的天然免疫细胞(如单核细胞,巨噬细胞或自然杀伤细胞)在机能上会出现长期的变化,会对微生物病原体的二次刺激反应增加,炎性介质产生增加,清除感染的能力增强,出现免疫记忆。那么我们在研究中探讨的M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞高表达免疫检查点分子是否也具有再次刺激反应增强现象?巨噬细胞如果刺激肝癌细胞高表达免疫检查点分子,那么巨噬细胞是否可以促进肝癌细胞的免疫逃逸?这些将是本研究的重要内容。研究目的巨噬细胞作为肿瘤微环境中重要的免疫细胞,能够帮助肿瘤细胞逃逸,促进肿瘤的生存发展。本课题我们探究M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞免疫检查点分子的表达情况。第一部分检测了 M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞表达免疫检查点分子 PD-L1,PD-L2,B7-H3,B7-H4,CD48,CD47,HVEM 和 Galectin9的情况。第二部分主要探究了 M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞表达免疫检查点分子具有再次刺激反应增强现象。第三部分通过动物实验,验证巨噬细胞可以促进肝癌细胞的免疫逃逸。研究方法及结果1、M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞高表达免疫检查点分子人单核细胞THP1接种于细胞培养板上,加入PMA诱导细胞贴壁,然后加入LPS和IFN-γ共刺激18h,得到M1型巨噬细胞。将上清弃去,用PBS清洗,换新鲜培养基,24h后获得M1型巨噬细胞上清。用M1型巨噬细胞上清刺激肝癌细胞系Huh-7细胞、BEL-7402细胞和SMMC-7721细胞,作为刺激组;正常培养的肝癌细胞作为对照组。然后收集细胞,提取RNA,逆转录成cDNA,RT-PCR检测多种免疫检查点分子mRNA水平的表达;或者收集细胞后,用荧光抗体染色,流式细胞术检测免疫检查点分子蛋白水平表达。(1)M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞多种免疫检查点分子在mRNA水平高表达采用RT-PCR检测M1型巨噬细胞上清对肝癌细胞免疫检查点分子PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD48、CD47、HVEM、Galectin9 mRNA 水平表达的影响。在Huh-7细胞中,与对照组相比,刺激组的PD-L1、B7-H3、B7-H4、CD48、CD47、Galectin9分子mRNA表达水平均有明显升高(P<0.05),而PD-L2和HVEM分子mRNA表达水平也有所升高,但是无显著性差异(P>0.05)。在BEL-7402 细胞中,刺激组的 PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD48、CD47、HVEM和Galectin9分子的mRNA表达水平与对照组相比均有明显升(P<0.05)。在 SMMC-7721 细胞中,刺激组的 PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD47、HVEM、Galectin9分子的mRNA表达水平与对照组相比均有明显升高(P<0.05),但CD48分子mRNA表达水平与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。(2)M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞多种免疫检查点分子在蛋白水平高表达.采用流式细胞术检测Huh-7细胞和BEL-7402细胞中PD-L1、CD47、HVEM和Galectin9分子蛋白水平的表达。在Huh-7细胞和BEL-7402细胞中,与对照组相比,刺激组PD-L1、HVEM和Galectin9分子的蛋白水平表达明显升高(P<0.05);在Huh-7细胞中,与对照组相比,刺激组CD47分子在蛋白水平表达明显升高(P<0.05)。2、M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞表达免疫检查点分子具有再次刺激反应增强现象用M1型巨噬细胞上清连续刺激肝癌细胞Huh-7、BEL-7402和SMMC-7721细胞48 h后,弃掉上清,用PBS清洗,加新鲜培养基静息培养6天(静息组),用M1型巨噬细胞上清再次刺激静息的肝癌细胞24 h(再次刺激组);同时采用M1型巨噬细胞上清直接刺激正常培养的肝癌细胞24 h,此为初次刺激细胞(初次刺激组),采用正常培养的肝癌细胞作为未刺激细胞(未刺激组)。收取细胞,提取RNA,逆转录成cDNA。或者收集细胞后,荧光抗体染色。(1)mRNA水平分析M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞表达免疫检查点分子具有再次刺激反应增强现象运用 RT-PCR 分别检测 4 组肝癌细胞 PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD48、CD47、HVEM和Galectin9分子mRNA水平的表达情况。在Huh-7细胞中,再次刺激组 PD-L1、B7-H3、B7-H4、CD48、CD47 和 Galectin9 分子 mRNA 表达水平与初次刺激组相比均显著性升高(P<0.05);而PD-L2和HVEM分子mRNA表达水平与初次刺激组相比无显著性差异(P>0.05)。在BEL-7402细胞中,再次刺激组 PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD48、CD47、HVEM、Galectin9分子mRNA表达水平与初次刺激组相比均明显升高(P<0.05)。在SMMC-7721细胞系中,再次刺激组 PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD47、HVEM、Galectin9分子的mRNA表达水平与初次刺激组相比均有明显升高(P<0.05),但CD48分子mRNA表达水平与初次刺激组相比无显著性差异(P>0.05)。(2)蛋白水平分析M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞表达免疫检查点分子具有再次刺激反应增强现象采用流式细胞术检测Huh-7肝癌细胞PD-L1和CD47分子,BEL-7402肝癌细胞PD-L1分子蛋白水平的表达。在Huh-7细胞中,再次刺激组PD-L1和CD47分子的蛋白水平与初次刺激组相比,结果均明显升高(P<0.05);BEL-7402细胞中,再次刺激组PD-L1分子的蛋白水平与初次刺激组相比,结果明显升高(P<0.05)。3、小鼠肝癌模型研究巨噬细胞促进肝癌细胞的免疫逃逸(1)将小鼠肝癌细胞Hepa1-6种板后,加入LPS和mouse-IFN-r激活的巨噬细胞上清刺激24h,弃去上清,换新鲜的上清继续刺激24h(共48h),将上清弃去,用高压无菌的PBS缓冲液洗3遍;加新鲜培养基静息培养6天(静息组),用LPS和mouse-IFN-r激活的巨噬细胞上清再次刺激静息的肝癌细胞24 h(再次刺激组);第6天同时采用LPS和mouse-IFN-r激活的巨噬细胞上清直接刺激正常肝癌细胞24h,此为初次刺激细胞(初次刺激组),采用正常培养的肝癌细胞作为未刺激细胞(未刺激组)。制成单细胞悬液,荧光抗体染色,采用流式细胞术检测PD-L1和CD47分子蛋白水平的表达。初次刺激组小鼠肝癌细胞表达PD-L1和CD47分子与未刺激组相比显著升高(P<0.05),再次刺激组小鼠肝癌细胞表达PD-L1和CD47分子与初次刺激组相比显著升高(P<0.05)。(2)在C57BL/6小鼠腹股沟注射正常培养的Hepa1-6肝癌细胞,2周后在免疫的小鼠腹部皮下分别注射正常培养的Hepa1-6细胞(对照组)和用LPS和mouse-IFN-γ激活的巨噬细胞上清刺激的Hepa1-6细胞(刺激组)。对照组和刺激组的小鼠在第三天都长出肿瘤,之后每3天测量一次两组小鼠肿瘤的体积大小,刺激组的小鼠肿瘤体积在第6天至第12天明显大于对照组小鼠肿瘤体积(P<0.05)。结论1、M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞高表达多种免疫检查点分子。2、M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞表达免疫检查点分子具有再次刺激反应增强现象。3、巨噬细胞可促进肝癌细胞免疫逃逸。