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植物转录因子WRINKLED1(WRI1)属于AP2/EREBP类转录因子成员,参与调控糖酵解及质体内脂肪酸从头合成相关基因的表达,是植物种子油脂合成积累的重要调节者。迄今,已从模式植物拟南芥、玉米、亚麻荠和油菜等普通油料作物发育种子克隆到编码转录因子WRI1的基因序列并做功能分析。蓖麻(RicinuscommunisL.)是重要工业油料作物,种子含油量高达60%,油脂主要积累在胚乳细胞,油脂中90%是功能独特的蓖麻酸。有关蓖麻转录因子WRI1种类、功能及调控活性的研究还未见报道。为解析蓖麻种子高水平合成积累油脂的机制,并鉴定获得具有高效调控活性的WRI1以用于在植物营养器官组装油脂富集代谢途径,本研究从蓖麻发育种子分离编码RcWRI1转录因子的cDNA克隆,分析RcWRI1基因结构及时空表达特性,构建RcWRI1超表达载体,对普通烟草进行遗传转化并鉴定转基因株系油脂组成等表型,系统分析RcWRI1的功能和应用于植物油脂代谢工程的价值。主要研究结果如下:1.以拟南芥编码AtWRI1的CDs序列为探针,对蓖麻基因组数据库进行BLAST分析显示,RcWRI1基因(LOC8283400)有两个选择性剪接转录本,命名为RcWRI1-A(1341 bp)和RcWRI1-B(1332bp)。应用高保真RT-PCR从蓖麻发育种子中成功克隆到这两个编码序列长度不同的RcWRI1剪接体。以拟南芥AtWRI1开放阅读框和蛋白质序列为对照,多序列比对分析显示,RcWR][1-B蛋白质序列(443AA)缺乏存在于RcWRI1-A(446AA)和AtWRI1中的三个氨基酸残基“VYL”。该“VYL”由RcWRI1基因第三个外显子(9bp)编码。2.设计特异性引物,应用荧光定量PCR(qRT-PCR),检测RcWRI1-A和RcWRI1-B在蓖麻不同组织器官的表达谱。结果显示,RcWRI1-A在蓖麻的花、叶、果皮和发育种子中均表达,但在各组织中的表达量差异显著。RcWRI1-B仅在发育种子中高量表达。3.构建种子特异性表达载体(pJC-Gly-DsRED-RcWRI1A/B),通过农杆菌花序浸染法将其转入拟南芥wri1-1功能缺失突变体中,获得纯合转基因株系。分析转基因种子表型,发现RcWRI1-A和RcWRI1-B都能使wril-1突变体的皱缩表型恢复至正常,并且使其含油量恢复至野生型水平。4.分别构建RcWRI1-A/B植物过表达载体(pCAMBIA1303-RcWRI1-A/B),通过农杆菌浸染法转化烟草获得转基因烟草株系,以野生型和转化空载体烟草植株为对照。TO代转基因烟草株系的DNA和mRNA分子鉴定显示,RcWRI1-A和RcWRI1-B已插入烟草基因组,并在叶片营养组织中高效表达。5.通过实时荧光定量PCR,检测转基因烟草中WRI1下游靶基因的表达量。与对照烟草植株相比,过表达RcWRI1-A和RcWRI1-B烟草植株WRI1下游相关靶基因的表达量增加了 2-3倍;在过表达RcWRI1-B的烟草中,这些靶基因的相对表达量更高。6.对转基因烟草株系叶片营养器官中油脂含量、淀粉含量和蛋白含量进行测定。与对照烟草植株相比,过表达RcWRI和RcWRI1-B烟草植株总油脂含量分别提高了 4.3-4.9倍,而且过表达RcWRI1-B的烟草比过表达RcWRI1-A含油量增加幅度更大。两类转基因烟草植株与对照相比,脂肪酸成分没有发生明显变化。超表达RcWRI1-A基因的烟草叶片组织中淀粉含量为21.6%。超表达RcWRI1-B基因的烟草叶片淀粉含量为21.3%,比对照烟叶淀粉含量降低2%左右。与对照相比,超表达RcWRI1-A或RcWRI1-B仅导致烟叶蛋白质含量轻微减少,分别为10.6%和10.3%,差异不显著。总之,RcWRI1基因两种剪接体RcWRI1-A和RcWRI1-B都具有转录调控活性,能显著促进营养组织富集油脂,且未产生明显的负效应。这两个RcWRI1剪接体可作为主效转录调节因子在茎叶营养器官组装富集油脂的代谢途径,以期用高生物量营养器官生产食用或工业用植物油。