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羰基还原酶能够催化许多手性醇的合成,为一系列医药和化工中间体的工业制造做出了相当大的贡献。尽管已经有一些重要的手性化学品和药品通过羰基还原酶的生物催化实现了高产量、低成本的工业生产,但还有更多的产品没有找到理想的生物催化剂。在本论文中,通过酶分子改造或酶库筛选的方法获得了性能优良的羰基还原酶,可用于催化重要药物中间体的生物合成。
蛋白质工程可以克服生物催化中几乎所有的挑战,使生物催化剂获得工业应用所需的催化性能。为了提高枯草芽孢杆菌WB600来源的羧基还原酶在重要药物中间体合成中的催化性能,本论文基于分子对接和丙氨酸筛选,对这个酶进行了半理性设计。光学纯1-苯乙醇及其衍生物是许多药物的手性前体。虽然目前已有几种生物合成策略可以将卤代苯乙酮转化为相应的(R)和(s)-醇,但其催化效率和立体选择性仍然远远低于工业应用的要求。由于对光学纯醇的需求在不断地增加,因此,有必要开发更强大的生物催化剂,高效地制备手性醇。本论文通过定点突变的方法成功地对碳基还原酶YueD进行了分子改造,获得了催化性能改善的突变体Val181Ala,用于苯乙酮及其衍生物的生物还原。同时,构建了一种酶偶联的辅因子再生系统,以木糖为辅底物,实现NADPH的胞内循环,并用于卤代苯乙酮的不对称还原。在含有0.18克/升木糖的反应体系中,突变体Val181Ala将各种卤代苯乙酮(500mM)还原为对应的(S)或者(R)-醇,光学纯度均大于99%,转化率达到85%-99%。随后,对酶和底物进行了对接分析,为突变体催化性质改变的结构基础和分子机理提供了解释。这些数据表明,突变体Val181Ala在高附加值手性醇的合成中具有广阔的应用前景。
在上述工作中,我们发现辅酶对于还原酶类的催化性能具有重要的影响。因此在后面的工作中通过在酶及其辅因子之间引入额外的氢键,对恶臭假单胞菌来源的脱氢酶进行了分子改造,以提高其催化活性。短链醇脱氢酶(SDR)是NAD(P)H依赖酶,在相应的辅因子存在的情况下催化氧化还原反应。为了探讨酶与辅因子的结合情况对短链醇脱氢酶活性的影响,本研究对SDH_p.p.4654进行了理性设计。计算分析表明,Aln89、Vln140和Aln89位于与辅因子相邻的位置,因此用长侧链的残基Trp来取代它们,以增加酶与底物之间的氢键相互作用。进一步的活性分析表明,SDR_p.p-4654的Aln89Trp突变使kcat/Km提高了3.4倍,Aln89Trp突变体对底物异丁醛的最大转化率达到67%。分子动力学模拟也表明,Aln89Trp突变体与NADP之间的氢键相互作用更强,结合能也增强了。此外,RMSD和RMSF分析结果表明,Ala89Trp突变体比野生型酶更稳定。以上数据表明,突变体Aln89Trp为异丁醇等生物燃料的生产提供了一个良好的生物催化剂,并且这项工作可以为其他NAD(P)H依赖酶的分子改造提供方法上的借鉴。同样,蛋白质工程策略还被用于重新设计PpySDR,以提高其对底物4-羟基-2-丁酮的催化活性,从而有效地进行重要药物中间体手性1,3-丁二醇的生物合成,但结果并不理想。除了酶分子改造,酶库筛选也是一种有效的获取高效生物催化剂的方法。通过对含有20个羰基还原酶的酶库进行筛选,发现来自Pichia finlandica的PODH和来自Candida parapsilosis的CpSADH这两个酶对4-羟基-2-丁酮具有很高的催化活性和对映体选择性。在无需外源添加辅因子的情况下,PFODH和CpSADH全细胞催化剂分别催化产生了光学纯R-和S-1-3-丁二醇,并且均表现出较高的底物/产物耐受性和良好的催化活性(转换率为81-90%)。同时,以异丙醇为辅底物,采用底物偶联系统促进了辅因子NADH的再生。进一步研究了PFODH和CpSADH对各种取代芳基酮的催化活性,发现几乎所有测试底物都被不对称还原为相应的手性醇,并且光学纯度都很高,达到97-99%。其中,PFDOH能够高效还原在羰基相邻位置取代的底物或在苯环的间位取代的底物。这些结果证明PFDOH和CpSADH在生物法制备光学纯1,3-丁二醇和其他有价值的手性醇方面极具工业潜力。
上述研究结果展示了蛋白质工程和酶库筛选都是获取高效生物催化剂的有效手段。在很多情况下酶的分子改造能够成功提高酶的催化效率和对高浓度非天然底物的耐受性,而在酶分子改造遇到困难时酶库筛选可以作为一种有效的备用方案,这两种方法都能获得高性能的生物催化剂,为手性醇的生物法合成奠定了基础。
蛋白质工程可以克服生物催化中几乎所有的挑战,使生物催化剂获得工业应用所需的催化性能。为了提高枯草芽孢杆菌WB600来源的羧基还原酶在重要药物中间体合成中的催化性能,本论文基于分子对接和丙氨酸筛选,对这个酶进行了半理性设计。光学纯1-苯乙醇及其衍生物是许多药物的手性前体。虽然目前已有几种生物合成策略可以将卤代苯乙酮转化为相应的(R)和(s)-醇,但其催化效率和立体选择性仍然远远低于工业应用的要求。由于对光学纯醇的需求在不断地增加,因此,有必要开发更强大的生物催化剂,高效地制备手性醇。本论文通过定点突变的方法成功地对碳基还原酶YueD进行了分子改造,获得了催化性能改善的突变体Val181Ala,用于苯乙酮及其衍生物的生物还原。同时,构建了一种酶偶联的辅因子再生系统,以木糖为辅底物,实现NADPH的胞内循环,并用于卤代苯乙酮的不对称还原。在含有0.18克/升木糖的反应体系中,突变体Val181Ala将各种卤代苯乙酮(500mM)还原为对应的(S)或者(R)-醇,光学纯度均大于99%,转化率达到85%-99%。随后,对酶和底物进行了对接分析,为突变体催化性质改变的结构基础和分子机理提供了解释。这些数据表明,突变体Val181Ala在高附加值手性醇的合成中具有广阔的应用前景。
在上述工作中,我们发现辅酶对于还原酶类的催化性能具有重要的影响。因此在后面的工作中通过在酶及其辅因子之间引入额外的氢键,对恶臭假单胞菌来源的脱氢酶进行了分子改造,以提高其催化活性。短链醇脱氢酶(SDR)是NAD(P)H依赖酶,在相应的辅因子存在的情况下催化氧化还原反应。为了探讨酶与辅因子的结合情况对短链醇脱氢酶活性的影响,本研究对SDH_p.p.4654进行了理性设计。计算分析表明,Aln89、Vln140和Aln89位于与辅因子相邻的位置,因此用长侧链的残基Trp来取代它们,以增加酶与底物之间的氢键相互作用。进一步的活性分析表明,SDR_p.p-4654的Aln89Trp突变使kcat/Km提高了3.4倍,Aln89Trp突变体对底物异丁醛的最大转化率达到67%。分子动力学模拟也表明,Aln89Trp突变体与NADP之间的氢键相互作用更强,结合能也增强了。此外,RMSD和RMSF分析结果表明,Ala89Trp突变体比野生型酶更稳定。以上数据表明,突变体Aln89Trp为异丁醇等生物燃料的生产提供了一个良好的生物催化剂,并且这项工作可以为其他NAD(P)H依赖酶的分子改造提供方法上的借鉴。同样,蛋白质工程策略还被用于重新设计PpySDR,以提高其对底物4-羟基-2-丁酮的催化活性,从而有效地进行重要药物中间体手性1,3-丁二醇的生物合成,但结果并不理想。除了酶分子改造,酶库筛选也是一种有效的获取高效生物催化剂的方法。通过对含有20个羰基还原酶的酶库进行筛选,发现来自Pichia finlandica的PODH和来自Candida parapsilosis的CpSADH这两个酶对4-羟基-2-丁酮具有很高的催化活性和对映体选择性。在无需外源添加辅因子的情况下,PFODH和CpSADH全细胞催化剂分别催化产生了光学纯R-和S-1-3-丁二醇,并且均表现出较高的底物/产物耐受性和良好的催化活性(转换率为81-90%)。同时,以异丙醇为辅底物,采用底物偶联系统促进了辅因子NADH的再生。进一步研究了PFODH和CpSADH对各种取代芳基酮的催化活性,发现几乎所有测试底物都被不对称还原为相应的手性醇,并且光学纯度都很高,达到97-99%。其中,PFDOH能够高效还原在羰基相邻位置取代的底物或在苯环的间位取代的底物。这些结果证明PFDOH和CpSADH在生物法制备光学纯1,3-丁二醇和其他有价值的手性醇方面极具工业潜力。
上述研究结果展示了蛋白质工程和酶库筛选都是获取高效生物催化剂的有效手段。在很多情况下酶的分子改造能够成功提高酶的催化效率和对高浓度非天然底物的耐受性,而在酶分子改造遇到困难时酶库筛选可以作为一种有效的备用方案,这两种方法都能获得高性能的生物催化剂,为手性醇的生物法合成奠定了基础。